乳頭狀甲狀腺癌NIS蛋白與糖酵解相關蛋白GLUT1及HK2表達關系的研究

中國醫科大學附屬第一醫院核醫學科，遼寧 沈陽 110000

甲狀腺癌作為臨床常見的一種惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%，且女性發病率高于男性[1-2]。與正常甲狀腺組織相比，甲狀腺癌組織對碘的攝取顯著減少，并且鈉碘同向轉運體（sodium iodide symporter，NIS）蛋白在轉錄水平和翻譯水平也有明顯降低，導致癌組織的聚碘能力差從而影響患者術后的療效[3-4]。與正常組織細胞不同，腫瘤細胞即使在氧氣充足的條件下也能使葡萄糖經過一系列酶促反應生成丙酮酸，進而產生乳酸及能量，該過程稱為“Warburg效應”[5]。越來越多的研究表明，Warburg效應存在于各種各樣的腫瘤細胞中，糖酵解可能是腫瘤細胞供能的主要方式[6-7]。研究證明葡萄糖轉運體1（glucose transporters 1，GLUT1）和己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）均參與惡性腫瘤糖酵解過程，可作為腫瘤細胞是否存在糖酵解亢進的標志蛋白[8-9]。實際上，甲狀腺腫瘤在PET/CT顯像中存在FDG攝取，而相應的131I-全身掃描（131I-whole body scan，131I-WBS）卻不顯影，這種碘攝取與糖攝取呈相反趨勢的現象促使我們探索NIS蛋白與糖酵解相關蛋白GLUT1、HK2之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年11月—2018年9月在中國醫科大學附屬第一醫院首次確診并切除病灶的乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）患者61例。其中女性44例，男性17例，平均年齡（43.84±12.28）歲。上述患者術前均無放化療史及免疫抑制劑治療史。

1.2 試劑與儀器

DAB染色劑、抗原修復液EDTA、二抗超敏試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司；兔抗人NIS（1∶50）、GLUT1（1∶500）及HK2（1∶500）蛋白一抗抗體購自英國Abcam公司；組織包埋機、切片機及離心機購自美國Thermo公司；顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3 方法

采用免疫組織化學技術檢測NIS、GLUT1及HK2蛋白的表達情況，并依其表達強度的平均值進行分組。NIS及GLUT1蛋白陽性結果判斷標準：目標蛋白定位于甲狀腺濾泡上皮細胞基底部質膜、周邊質膜或細胞質中，以染色呈淡黃色到棕褐色不等為陽性，無著色為陰性結果。HK2蛋白陽性標準：以細胞質或細胞膜周邊出現棕黃色顆粒為陽性，細胞中無著色為陰性。免疫組織化學評分標準根據吳亞等[17]報道，即染色評分標準。① 陽性細胞所占百分比：隨機選取5個不同視野，其中陽性細胞所占百分比小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。② 陽性染色強度：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。選擇（×400）倍視野，隨機選取五個視野進行評分，以陽性細胞所占百分比與陽性染色強度的乘積作為染色評分，將5個視野評分結果取平均值作為最終評分結果。

1.4 分組方法

本研究對PTC中NIS、GLUT1及HK2蛋白進行免疫組織化學評分，樣本例數為61例，且NIS、GLUT1及HK2三種蛋白表達強度近似正態分布，均以其平均表達強度區分高低表達。其中NIS蛋白在癌及正常組織中的平均表達強度為（7.19±1.70vs7.90±1.21），以NIS蛋白的平均表達強度作為分組標準，分為高表達組和低表達組，進一步分析NIS蛋白高/低表達組中GLUT1及HK2的表達差異及其相互關系。

1.5 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料均以±s表示。計量資料采用配對樣本t檢驗和獨立樣本t檢驗，且數據經K-S檢驗服從正態分布；計數資料采用χ2檢驗。兩變量間相關性研究采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PTC中NIS、GLUT1及HK2蛋白在癌及正常組織中的表達

癌組織中NIS蛋白的平均表達強度低于正常組織（7.19±1.70vs7.90±1.21），GLUT1及HK2蛋白的平均表達強度明顯高于正常組織（9.00±1.94vs7.39±1.31；7.36±1.68vs6.64±1.43）；NIS、GLUT1及HK2蛋白在癌及正常組織中表達的差異均有統計學意義（t=-3.251、6.54、2.801，P＜0.05，圖1，表1）。

2.2 PTC及正常組織中GLUT1和HK2在NIS蛋白高低表達組中的差異

癌組織中HK2在NIS蛋白高低表達組中表達的差異有統計學意義，且呈正相關（t=2.324，P＜0.05；r=0.404，P＜0.05）。GLUT1蛋白在NIS蛋白高低表達組中表達的差異無統計學意義，且無相關性（t=-1.020，P＞0.05；r=0.038，P＞0.05）。正常組織中，HK2蛋白在NIS蛋白高低表達組中表達的差異有統計學意義，但無相關性（t=2.357，P＜0.05；r=0.246，P＞0.05）。GLUT1蛋白在NIS蛋白高/低表達組中表達的差異無統計學意義，且無相關性（t=0.253，P＞0.05；r=-0.177，P＞0.05）。詳見表2，圖2～3。

2.3 NIS、GLUT1及HK2蛋白表達的臨床意義

本研究分別以年齡[平均值（43.84±12.28）歲]、腫瘤大小[平均值（17.80±8.72）mm]、是否伴有淋巴結轉移及TNM分期進行分組。結果顯示，NIS蛋白在腫瘤大小分組中的表達差異有統計學意義（P＜0.05），HK2和GLUT1蛋白在腫瘤大小分組中的差異無統計學意義（P＞0.05）。NIS、GLUT1及HK2表達情況在年齡、是否伴有淋巴結轉移及TNM分期差異無統計學意義（表3）。

典型患者影像圖及免疫組織化學圖見圖4。

圖1 NIS、GLUT1及HK2蛋白在正常組織及癌組織中的表達

表1 NIS、GLUT1及HK2蛋白在癌組織及正常組織中的表達

表2 PTC及正常組織中GLUT1和HK2在NIS蛋白高低表達組中的表達

圖2 PTC癌組織中GLUT1及HK2在NIS蛋白高低表達組中的表達情況

圖3 PTC正常組織中GLUT1及HK2在NIS蛋白高低表達組中的表達情況

表3 癌組織中NIS、GLUT1及HK2蛋白高表達與臨床病理學參數的關系

圖4 典型患者（患者，男性，57歲，診斷為PTC）影像圖及免疫組織化學圖

3 討 論

3.1 NIS在PTC中的意義

近些年甲狀腺癌逐漸成為常見的惡性腫瘤之一，其發病率與性別、年齡及分布地區有關，并且逐漸成為發病率增速最快的癌癥[11-12]。NIS作為轉運鈉離子和碘離子的糖化膜蛋白，主要表達于甲狀腺濾泡上皮細胞基底膜外側，并且其表達水平與甲狀腺癌的發生、發展有著密切的關系。本研究中，NIS蛋白在癌組織與正常組織中的表達差異有統計學意義（P＜0.05），同時本研究中約有31%的甲狀腺癌組織的NIS表達水平與正常組織相當，甚至略超過正常組織，而這種個別過表達的現象與Dohán等[13]研究結果相近。Saito等[14]研究同樣提示NIS蛋白在甲狀腺癌與正常組織中表達存在差異，分化良好的甲狀腺癌組織中的NIS表達水平高于分化較差的組織，同時存在癌組織中NIS蛋白過表達的現象。

3.2 甲狀腺癌中的糖酵解過程

糖酵解作為腫瘤細胞常見的能量代謝方式同樣存在于甲狀腺癌中，由于產能效率不及有氧氧化，導致惡性腫瘤細胞必須攝取大量的葡萄糖以滿足其增殖分化之需要。細胞攝取葡萄糖主要依賴于細胞膜上的GlUT1及HK2等蛋白。有研究顯示，GLUT1在甲狀腺癌中呈高表達[15]，同時GLUT1表達與甲狀腺癌的分化程度密切相關，即GLUT1蛋白在甲狀腺低分化癌或未分化癌中的表達最高，其表達越高表明甲狀腺癌的糖代謝能力越強[16]。本研究結果顯示，GLUT1及HK2蛋白表達在甲狀腺癌及正常組織中表達的差異有統計學意義（P＜0.05）。在癌組織中GLUT1及HK2蛋白表達強度普遍高于正常組織，這種現象與吳亞等[17]研究結果相符。雖然本研究并未發現GLUT1及HK2蛋白表達在年齡、腫瘤大小、是否伴有淋巴結轉移及TNM分期分組中存在差異，但Matsuzu等[18]研究結果顯示，GLUT1蛋白在腫瘤分期方面的差異有統計學意義，提示GLUT1蛋白可作為判斷腫瘤分期的指標。

3.3 NIS蛋白與GLUT1、HK2蛋白的關系

NIS、GLUT1及HK2蛋白不僅是甲狀腺癌組織碘代謝與糖代謝的基礎，也是臨床工作中131I-WBS及PET/CT顯像的基礎。本研究結果提示，癌組織中HK2蛋白與NIS蛋白的表達呈正相關，而GLUT1蛋白與NIS蛋白無明顯相關性。同時NIS蛋白在腫瘤大小分組中表達存在差異，而GLUT1及HK2蛋白無明顯差異。有研究認為GLUT1在有淋巴結轉移組中的表達高于無淋巴結轉移組，但差異無統計學意義[18]，與本實驗研究結果相同。Jung等[19]認為，PTC中存在的碘代謝和糖酵解之間的關系可以為判斷甲狀腺腫瘤分化情況提供幫助。本研究中未見NIS、GLUT1及HK2蛋白表達在腫瘤分期分組中存在差異，可能與本研究納入的甲狀腺癌類型及樣本數量有關。

3.4 PTC 131I-WBS與PET/CT顯像

臨床工作中，131I-WBS作為甲狀腺癌術后的隨訪方式，但由于PTC及其轉移灶常發生失分化，使其攝碘功能降低或喪失，導致131I-WBS對病灶檢出率較低[20-21]。臨床上有10%～15%的PTC在轉移過程中發生失分化引起細胞攝碘功能降低或消失，造成131I-WBS探測PTC及轉移灶時呈假陰性[22-23]。Feine等[24]的研究首先發現“觸發現象”（flip-flop），認為甲狀腺癌及轉移灶中存在131I攝取與FDG攝取之間的相反關系，這為甲狀腺癌131I-WBS聯合PET/CT顯像提供了方向。131I-WBS和18F-FDG PET/CT在分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）術后患者轉移灶探測及決定下一步的治療方案方面具有良好的互補性，特別是18F-FDG PET/CT在Tg（+）、131I-WBS（-）患者轉移灶檢出上更具有優勢，其顯像的靈敏度為79.3%[25-26]。本研究從蛋白層面上分析了PTC中碘代謝關鍵蛋白NIS與糖代謝相關蛋白GLUT1及HK2的關系，其在癌組織中的表達關系為實際臨床工作中PTC131I-WBS存在假陰性，而相應PET/CT顯像存在18F-FDG攝取這種反轉現象提供了解釋。本研究發現個別患者131I-WBS和PET/CT顯像同時存在攝取（圖4），可能與本實驗選取的甲狀腺癌類型較單一有關；同時由于PTC為分化型甲狀腺癌且分化較好，癌組織NIS蛋白并未完全失去攝碘功能，而相應組織同時存在糖酵解過程。131I-WBS和PET/CT顯像的反轉現象還需后續實驗驗證。