成人過敏性紫癜腎炎外周血Treg/Th17細胞軸表達與中醫證型的相關性＊

薛 雪，柳 強，王小琴＊＊，袁 軍，韓四萍

（1. 湖北中醫藥大學第一臨床學院 武漢 430061；2. 湖北省中醫院腎病科 武漢 430061）

過敏性紫癜是全身免疫性小血管炎，臨床特點為紫癜樣皮疹，常伴關節和消化道癥狀，出現腎臟受累稱為過敏性紫癜腎炎(Henoch-schonlein purpura nephritis,HSPN)，主要表現為血尿和（或）蛋白尿，甚則腎功能損傷[1]。HSPN 是一種常見的繼發性腎病，所有年齡段均可發生，好發于兒童，在兒科疾病中被認為是一類典型的自限性疾病，成人發病則不然，病情較患兒嚴重，腎臟受累后會尤其明顯[2]。流行病學資料顯示，成人HSPN 發病率呈上升趨勢，病情復雜，易反復發作，治療棘手。目前該病發病機制仍不明確，現代醫學治療亦存在爭議，有限的幾項隨機對照研究結果顯示皮質激素、免疫抑制劑及支持治療效果并不理想[3-5]。因此進一步研究該病的發病機制并尋求有效的中西醫結合治療手段十分必要。

調節性T細胞(Regulatory T cell,Treg cell)和輔助性T 細胞 17(T helper 17 cell,Th17 cell)是 CD4+T 淋巴細胞來源的亞群，對維持機體免疫平衡至關重要[6]。Treg細胞主要通過細胞因子白介素-10(interleukin-10,IL-10)和轉化生長因子-β 在機體免疫系統中發揮負向調節作用，既能抑制不恰當免疫反應,又能限定免疫應答的范圍、程度及作用時間,從而維持免疫穩態[7]。叉頭翼狀螺旋核轉錄因子3(Forkhead/winged helix nuclear transcription factor 3,Foxp3)高表達于CD4+CD25+Treg 細胞，是Treg的特征性標志,亦是其特異性轉錄因子。而Th17 細胞主要通過分泌促炎細胞因子來介導自身免疫的發生發展，由于高水平分泌白介素-17(Interleukin-17,IL-17)而被命名為Th17 細胞，維甲酸受體相關孤兒受體γt(Retinoic receptor-related orphan receptor γt,RORγt)是其特異性轉錄因子[8]。現已觀察到在多種自身免疫性腎病中都廣泛存在著Treg/Th17細胞軸平衡失調[9-13]。隨病情加重，Treg/Th17 細胞軸失衡也更加明顯。但目前尚不清楚該細胞軸與成人HSPN 的發病是否相關。本研究通過分析成人HSPN患者外周血Treg/Th17細胞軸的表達，進一步研究該病的發病機制，同時探討該細胞軸失衡與中醫證型之間的相關性，為臨證運用中醫藥辨證論治提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究組43例成人HSPN患者來自湖北省中醫院腎病科門診（過敏性紫癜性腎炎隊列研究JDZX2015194），其中男性19 例，女性24 例，年齡20-65 歲，平均年齡（37.33±10.47）歲；平均病程（55.65±37.54）月。對照組為13 名健康受試者，其中男性6 名，女性7 名，年齡26-56歲，平均年齡（32.85±9.45）歲。兩組研究對象性別、年齡的比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究得到湖北省中醫院倫理委員會批準并取得所有受試者的知情同意（倫理批件號：HBZY2019-C37-01）。

1.1.1 研究組（HSPN受試者）診斷標準

西醫診斷標準：2011 年中華醫學會主編《臨床診療指南-腎臟病學分冊》（人民衛生出版社）HSPN 診斷標準。

中醫病名及中醫本證證型診斷標準：參照2019年1 月由中華中醫藥學會發布，湖北省中醫院牽頭修訂的中醫臨床診療指南中紫癜腎（過敏性紫癜腎炎）中病名及中醫本證證型診斷。

1.1.2 研究組（HSPN受試者）納入及排除標準

納入標準：①年齡18-60歲；②符合上述診斷標準的患者；③經腎臟病飲食改良(modification of diet in renal disease,MDRD)公式計算的腎小球濾過率＞60 mL·（min·1.73m2）-1；④24 h 尿蛋白定量≤3.0 g；⑤提供知情同意并配合完成研究所需要的流程。

排除標準：①妊娠期或哺乳期婦女；②正在參與干預性臨床實驗的患者；③既往3 個月內或正在因HSPN 接受皮質激素及免疫抑制劑治療者；④1 型或2型糖尿病患者；⑤美國紐約心臟病學會心功能分級Ⅲ級或Ⅳ級心力衰竭患者，即有基礎心臟疾病，體力活動明顯受限，小于一般體力活動甚至休息狀態下即可出現疲乏、心悸、氣喘或心絞痛癥狀的患者；⑥病毒性肝炎或肝硬化患者；⑦艾滋病毒感染患者；⑧惡性腫瘤患者；⑨既往接受超過1個月的透析治療，和（或）器官或骨髓移植患者；⑩既往診斷為多囊腎等遺傳性腎臟疾病患者。

1.1.3 對照組（健康受試者）納入及排除標準

納入標準：①年齡18-60 歲；②血、尿、糞便常規，肝腎功能，血脂等項目在體檢報告中屬于正常范圍；③提供知情同意。

排除標準：①既往有高血壓、糖尿病、冠心病、高尿酸血癥或高脂血癥等慢性病病史者；②既往有遺傳病病史者；③既往有支氣管哮喘、皮肌炎、濕疹、甲狀腺炎、潰瘍性結腸炎、類風濕關節炎、強直性脊柱炎、腎小球腎炎等自身免疫、過敏性疾病病史者；④惡性腫瘤患者；⑤合并急性感染者；⑥合并病毒性肝炎、尖銳濕疣等慢性感染性疾病者。

1.2 主要試劑和儀器

PerCP Mouse Anti-Human CD4(SK3)（貨號347324）、FITC Mouse Anti-Human CD25（貨號555431）、PE Mouse anti-Human Foxp3（貨 號 560852）、Human Th1/Th2/Th17 phenotyping Kit（貨號 560751）、破膜劑 FACS Permeabilizing Satution2（貨號340973）、紅細胞裂解液FACSTM Lysing Solution (10X)（ 貨 號 349202）、BD GolgiStop?Protein Transport Inhibitor（貨號51-2092KZ）均購自美國 BD 公司；TRIzol 液購自 Ambion 公司(貨號15596026)；cDNA 第一鏈合成試劑盒購自 TAKARA 公司(貨號 639505)；SYBR Green PCR 試劑盒購自 KAPA Biosystems 公司(貨號 KM4101)；DNase I 生產廠家為立陶宛Fermentas 公司（貨號AM2295）；聚合酶鏈反應引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成；IL-17、IL-10 酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自Bioswamp 公司（IL-17 貨號 HM10198，IL-10 貨號 HM10203）。FACS Calibur 流式細胞儀購自美國BD 公司；熒光定量聚合酶鏈擴增儀(儀器型號CFX-Connect96)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 檢測Treg細胞

采用流式細胞術測定CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+百分率。取兩只試管，分別標記為樣本檢測管及陰性對照管。分離受試者外周血單個核細胞，按照標準操作調整細胞懸液濃度。向試管中加入4℃Anti-CD4-PerCP 及Anti-CD25-FITC 單克隆抗體，常溫避光孵育20 min。再加入紅細胞裂解液2 mL，混勻后室溫避光孵育10 min。固定重懸細胞后加入破膜劑常溫避光孵育10 min，加入Anti-Foxp3-PE，室溫避光孵育20 min，洗滌重懸處理后上機檢測。通過Cellquest 軟件進行收集分析數據。

1.3.2 檢測Thl7細胞

采用流式細胞術測定CD4+IL-17A+細胞/CD4+細胞百分率。取兩只試管，分別標記為樣本檢測管及陰性對照管。分離受試者外周血單個核細胞，調整細胞懸液濃度，按照標準操作濃度加入BD GolgiStop?蛋白轉運抑制劑刺激細胞之后，混勻放置細胞培養箱中培養5 h。固定破膜處理后向試管中加入4℃Human Th1/Th2/Th17 phenotyping Kit 中 的 CD4-PerCP-Cy5.5 與IL-17A-PE 抗體，室溫避光孵育30 min 后洗滌、重懸上機檢測。通過Cellquest軟件進行收集分析數據。

1.3.3 檢測Foxp3 mRNA、RORγt mRNA

采用實時定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)方法測定。106個細胞的離心管中加入 TRIzol 液 1.0 mL 提取總 RNA，利用 TAKARA 試劑盒進行cDNA 第一鏈合成，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。Primer Premier 5.0 軟件參照GenBank cDNA 序列設計 Foxp3、RORγt 及 βActin 引物，具體序列如下：Foxp3 5’-ACCAAGGCTTCATCTGTG-3’，5’-CTCTGGGAATGTGCTGTT-3’，產物大小 216 bp；RORγt 5’ -TCCACTACGGGGTTATC-3’ ， 5’ -TGTCCCTCTGCTTCTTG-3’，產物大小 171 bp；內參βActin 5’ -ACACTGTGCCCATCTACG-3’ ， 5’ -TGTCACGCACGATTTCC-3’，產物大小153 bp。采用SYBR Green PCR 試劑盒進行實時PCR 擴增上下游引物各 5 μmol，反應體系為 20 μL：SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 8μL。反應程序：95℃，3 min；95℃，5 s；56℃，10 s；72℃，25 s；39 個循環；65℃，5 s；95℃，50 s。擴增結束后采用儀器自帶軟件qbase plus進行數據分析。

1.3.4 檢測IL-17、IL-10

采 用 酶 聯 免 疫 吸 附 法 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定。予 IL-17、IL-10 酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測IL-17、IL-10 濃度。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 樣本量計算

根據第七版《流行病學》（王建華，2008，人民衛生出版社）兩樣本均數比較的樣本含量估計計算公式。參照兒童紫癜性腎炎相關文獻[8]，過敏性紫癜腎炎患兒血清Treg 細胞陽性率為(3.1±1.1)%，正常兒童血清Treg 細胞陽性率為(4.9±1.4)%。兩組合并標準差為1.25。設α=0.05（雙側）、β=0.1；查表得f（0.05，0.1）=10.5。將各數值帶入公式計算后得出n=10。考慮研究組涉及與三種中醫證型的相關性研究，預估樣本量不少于30例；對照組樣本量不少于10例。

1.5 統計學方法

應用SPSS 23.0 軟件進行數據分析。呈正態分布的計量資料用(-)表示，計數資料用百分比表示。用科爾莫戈羅夫-斯米爾諾夫檢驗（Kolmogorov-Smirnov test）判斷計量資料是否呈正態分布。符合正態分布的兩組計量資料間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用方差分析。P<0.05為有顯著差異。

2 結果

2.1 成人HSPN患者外周血Treg及Th17的表達水平

流式細胞術檢測結果顯示研究組及對照組受試者外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+百分率分別為(4.29±1.50)%和(6.44±2.90)%，提示成人HSPN 患者外周血Treg 表達水平較健康受試者下降(P<0.05（)圖1，表1）。研究組及對照組受試者外周血CD4+IL-17A+/CD4+百分率分別為(4.03±1.67)%和(2.65±1.55)%，提示成人HSPN 患者外周血Th17 表達水平較健康受試者升高(P<0.05（)圖2，表1）。

2.2 成人 HSPN 患者外周血 Foxp3 及 RORγt mRNA 的表達水平

實時定量PCR 檢測結果顯示研究組及對照組受試者外周血 Foxp3/βActin 分別為 1.26±0.04 和 1.29±0.05，提示成人HSPN 患者外周血Foxp3 mRNA 表達水平較健康受試者下降(P<0.05)。研究組及對照組受試者 外 周 血 RORγt/βActin 分 別 為 1.30±0.05 和 1.27±0.03，提示成人 HSPN 患者外周血 RORγt mRNA 表達水平較健康受試者升高(P<0.05)(表1)。

圖1 健康受試者/HSPN患者外周血Treg表達

圖2 健康受試者/HSPN患者外周血Th17表達

表1 成人HSPN外周血Treg與Th17、Foxp3與RORγt mRNA、IL-10與IL-17表達結果比較

2.3 成人HSPN患者血清IL-10及IL-17的濃度

ELISA 檢測結果顯示研究組及對照組受試者血清IL-10 的濃度分別為（106.57±9.47）pg/mL 和（174.21±32.18）pg/mL，提示成人 HSPN 患者血清 IL-10 水平較健康受試者明顯下降(P<0.01)。研究組及對照組受試者血清 IL-17 的濃度分別為（362.13±67.53）pg/mL 和（167.09±24.97）pg/mL。提示成人HSPN 患者血清IL-17水平較健康受試者顯著升高(P<0.01)(表1)。

2.4 成人HSPN患者中醫證型分布情況

本研究中氣陰兩虛證患者23 例，其中男性11 例，女性 12 例，平均年齡（36.22±12.73）歲，平均病程（49.48±21.81）月；脾腎氣虛證患者12 例，其中男性4例，女性 8 例，平均年齡（38.33±7.33）歲，平均病程（43.00±18.01）月；肝腎陰虛火旺證患者8例，其中男性4 例，女性 4 例，平均年齡（39.00±7.45）歲，平均病程（92.38±67.15）月。各組在年齡、性別、病程方面差別無統計學意義(P>0.05)(表2)。

2.5 不同中醫證型的成人HSPN 患者外周血相關免疫指標表達結果

成人HSPN 氣陰兩虛證患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+百分率(3.64±1.25)較脾腎氣虛證患者(5.29±1.47)顯著降低(P<0.01)。氣陰兩虛證患者IL-10 濃度[(103.37±9.40)pg·mL-1]較 脾 腎 氣 虛 證 患 者 [(112.86±8.29)pg·mL-1]顯著降低(P<0.01)。肝腎陰虛火旺證患者 IL-17 濃度[(419.34±61.73)pg·mL-1]較氣陰兩虛證患者[(358.99±70.09)pg·mL-1]升高(P<0.05)。肝腎陰虛火旺證患者IL-17 濃度[(419.34±61.73)pg·mL-1]較脾腎氣虛 證 患 者 [(330.02±40.46)pg·mL-1]顯 著 升 高 (P<0.01)(表 3)。

3 討論

在本研究中，研究結果表明成人HSPN 患者外周血Treg 細胞百分率與Treg 特異性轉錄因子Foxp3 mRNA 及其有效細胞因子IL-10 的表達水平明顯下降，低于健康受試者。而Th17 細胞百分率與Th17 特異性轉錄因子RORγt mRNA 及其分泌的細胞因子IL-17的表達水平顯著增加，高于健康受試者。從而證實成人HSPN患者存在Treg/Th17細胞軸免疫失衡。Treg細胞抑制炎癥反應并維持免疫穩態而Th17 細胞引起自身免疫和炎癥。其中IL-10發揮抑制局部炎癥反應作用同時也是Treg 體內外主要誘導增殖和促生長的細胞因子[14]；而前炎性細胞因子IL-17 則具有強大的促炎作用，能生產多種促炎趨化和細胞因子誘發自身免疫和炎癥[15]。CD4T細胞亞群并非固定不變，當受到不同細胞因子刺激時，它們可以轉化為其他亞型。HSPN 在一系列免疫炎癥反應中發生，促炎環境又進一步導致Th17 細胞分化過多，惡性循環導致疾病不斷發展，病情反復。以上結論與既往紫癜性腎炎患兒的相關研究結果相符[16-17]。所以機體維持Treg/Th17 細胞軸的平衡至關重要，在很大程度上將會避免自身免疫和炎癥反應發生。因此糾正HSPN 患者Treg/Th17 細胞軸失衡可以作為治療該病的策略及研究方向。

表2 成人HSPN患者中醫證型分布情況比較

表3 不同中醫證型的成人HSPN患者外周血相關免疫指標表達結果比較

古代中醫典籍中并無“過敏性紫癜腎炎”的病名，近代中醫多將其歸屬于“葡萄疫”“紫斑”“尿血”等范疇。2010 年國家中醫藥管理局重點專科優勢病種腎病協作組根據該病血尿、蛋白尿、皮疹、紫癜等臨床表現，將其命名為“紫癜腎”[18]。結合臨床急性發作與遷延反復的特點，常把該病分為急性期與慢性（遷延）期兩個階段來辨證論治。患者急性期多因風熱、毒邪致病，熱毒入血，燔熾營血，擾動腎絡，迫血妄行，血液不循常道溢于脈外肆虐發為紫斑、血尿。急性期過后實邪入里進入遷延期，火熱熏灼，熱毒耗傷陰血，虛火內生，迫血妄行；壯火極易食氣，氣虛不能攝血，血溢脈外；離經之血留積腎絡，蓄結為瘀。該病總體病理性質當屬氣血陰陽失調，虛實夾雜。虛證乃氣虛與陰虛共存；實證乃瘀血與熱毒互結，共同構成該病發生發展的病理基礎。目前，多種免疫性疾病Treg/Th17細胞軸失衡與中醫病證之間的相關性研究是近年來的研究熱點之一，但關于HSPN 的研究報道甚少。在慢性免疫性血小板減少癥的研究中發現，在本虛方面，Treg計數在氣虛患者中最低，其次為陰虛患者[19]。在類風濕關節炎患者不同中醫證型外周血Th17/Treg 細胞表達特點的研究中發現該病以痰、濕為基本病理因素，臨證有寒化、熱化、兼瘀等證候變化，其中，兼熱、兼瘀的患者其Th17 細胞均為高表達[20]。此外，在乙肝相關性慢加急性肝衰竭的研究中，瘀熱患者多處于疾病的初期及中期，此時機體處于免疫炎癥反應亢進狀態，Th17 細胞及相關因子IL-17A 升高明顯，隨著病程進展至末期，正氣虧虛明顯，Treg 細胞特異性轉錄因子Foxp3 mRNA 表達逐漸下降[21]。結合“紫癜腎”該病發生發展的病理基礎及Treg/Th17 細胞軸失衡的研究結論，考慮成人HSPN 患者Treg 細胞軸表達下降可能與機體氣虛及陰虛密切相關，而Th17細胞軸表達上升可能與體內瘀熱偏亢相關。與上述既往研究中免疫炎癥性疾病不同病理因素與相應免疫指標的變化趨勢相似[19-21]。

本研究發現，在成人HSPN 慢性（遷延）期中醫本證證型中以氣陰兩虛證最為多見，其次為脾腎氣虛證及肝腎陰虛火旺證。肺氣虛衛外功能下降易感受外邪發病，脾氣虛不能統攝，血溢脈外，腎氣虛不能封藏，精微下注，發為血尿、蛋白尿；陰虛火旺迫血妄行，外滲于肌膚見紫斑，內走臟腑脈絡見血尿。氣陰兩虛證患者臨床常表現為皮膚紫癜反復，易感冒，血尿，蛋白尿，腰酸乏力，口干咽干等癥狀，與肺、脾、腎三臟虛損有很大關系。脾腎氣虛證患者以蛋白尿血尿并見，倦怠乏力，氣短懶言，口淡不渴，食少腹脹，下肢輕度水腫為常見癥狀，主要累及脾、腎兩臟。肝腎陰虛火旺證患者以頭暈耳鳴，目干澀痛，手足心熱，盜汗，大便干燥，腰膝酸軟為主要表現，累及肝、腎兩臟。隨病情進展終致陰陽俱虛，脾陽虧虛水濕不得運化，中焦升降失調，腎陽虛衰化氣行水失功，下焦開闔無權，水濕停聚外滲肌膚，臨證出現面浮肢腫、尿少，脾腎衰敗后濕濁毒邪內聚彌漫三焦，小便不通與納差嘔惡并見，發為“慢性腎衰竭”“關格”重癥。本研究納入的HSPN患者腎小球濾過率均大于60 mL·(min·1.73m2)-1，隨著腎功能進一步下降，陰損及陽，陰陽俱虛，當屬“慢性腎衰病”的范疇，本研究暫不討論。

此外，研究結果提示HSPN 氣陰兩虛證型患者外周血Treg及IL-10的表達水平較其他中醫證型下降明顯。結合Treg和IL-10能夠抑制不恰當免疫反應的特點，不防推測臨床運用益氣養陰方藥能夠升高HSPN患者外周血Treg 和IL-10 的表達水平,恢復自身免疫調節能力，抑制不恰當的免疫反應發生。而HSPN 肝腎陰虛火旺證型患者外周血IL-17濃度升高較其他證型明顯。由于IL-17 是強效促炎細胞因子，陰虛火旺日久內熱與瘀血互結，故而運用滋陰降火、清熱涼血方藥則能夠降低IL-17 的表達水平，在一定程度上抑制免疫炎癥的發生發展。在整個過程中，機體Treg/Th17 細胞軸失衡與氣血陰陽失調變化密切相關。因此，在調節氣血陰陽治則的指導下，靈活應用益氣養陰、清熱涼血等具體治法調節免疫，糾正Treg/Th17 細胞軸失衡不失為一條治療HSPN 的新思路，為下一步研究中醫藥治療該病提供理論基礎。