培養基類型和植物生長物質濃度對王棗子愈傷組織誘導和繼代的影響＊

張媛媛，朱智慧，張苗苗，蘇 勇，方政宇，孫 偉，薛建平＊＊

（1. 淮北師范大學生命科學學院安徽省特色資源植物利用工程實驗室 淮北 235000；2. 中國中醫科學院中藥研究所 北京 100700）

王 棗 子Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan 系唇形科香茶菜屬多年生草本植物，學名香茶菜[1]，又被稱為蛇總管[2]、鐵角棱、山薄荷、痱子草等[3]，其根、莖和葉皆可入藥[4]，具有藥食兩用功能[5]。王棗子廣泛分布于河南、安徽、湖北、浙江、廣西、江蘇等地[6]，“宿州王棗子”成為安徽宿州市獲得的地理標志證明商標之一[7]，民間常用于治療毒蛇咬傷、肺膿瘍、惡瘡和急性肝炎等疾病[2,8]，具有抑菌消炎、解熱鎮痛[4]、抗氧化[9-10]和抗腫瘤[11-12]等作用。研究[13-16]表明，王棗子的主要活性成分為王棗子甲素、王棗子乙素和王棗子丙素等二萜類化合物以及齊墩果酸、熊果酸等三萜類化合物，被譽為“天然植物抗生素”。王棗子因其毒性低、副作用小和安全性高等優點，應用前景較為廣闊。

近年來，隨著對王棗子藥用功能的深入研究，王棗子的需求日益增大。由于野生王棗子的生長環境限制、生長速度慢和過度采挖，導致王棗子野生資源驟減。因此，利用植物細胞工程技術開展細胞組織培養法大規模生產王棗子有效成分研究具有重要的現實意義。利用細胞懸浮培養體系大規模生產植物細胞內的有用次生代謝產物首先要獲得疏松的愈傷組織，這是進行植物細胞懸浮培養的重要前提。目前，對于王棗子的研究主要集中在成分鑒定(如王棗子甲素、王棗子乙素和王棗子丙素[13-15]和三萜類鑒定[16,24])、抗氧化活性的研究[10]、提取物總黃酮的治病機制[25]、臨床抗菌作用[4]、王棗子乙素新型給藥系統的制備[26]、種子萌發條件的探究[27]、試管苗的繼代快繁[29]和再生體系的構建[30]等方面。劉芳等[28]以王棗子的莖、葉篩選了外植體的類型，在此基礎上研究了誘導王棗子愈傷組織最佳NAA（α-萘乙酸）與2，4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）的濃度配比，在試驗中我們發現，該配方得到的愈傷組織狀態不佳且容易褐化，影響后續再生體系的構建以及基因功能的驗證。

基本培養基是愈傷組織誘導和控制愈傷組織結構狀態的關鍵條件，愈傷組織的生長對無機鹽濃度的要求較高，基本培養基中的某些成分亦可起到外源調控因子的作用從而影響愈傷組織的形態結構，含有高鹽和高硝酸鹽的培養基對愈傷組織的誘導和細胞的培養有利，含有中鹽和低鹽的培養基對根的形成有利[20-21]。王海波等[22]在研究培養基類型對小麥愈傷組織狀態的影響時發現硝態氮會抑制愈傷組織的生長，還原態氮促進愈傷組織的生長。B5、MS、1/2MS 和N6培養基是愈傷組織常用的誘導培養基。王棗子的組織培養一般采用MS 培養基，在試驗中發現愈傷組織的狀態不佳，且容易褐化。植物生長在物質是愈傷組織增殖培養的關鍵因素，繼代愈傷組織活力較弱的可增大生長素的使用量，愈傷組織活力強的通過加大細胞分裂素的使用量來調節愈傷組織的生長狀態。不同質地的愈傷組織可通過生長素與細胞分裂素的種類和濃度配比來調控，增大生長素濃度愈傷組織的質地越疏松[23]。本試驗研究了不同的培養基類型對愈傷組織誘導的影響和添加不同濃度配比植物生長物質對王棗子疏松愈傷組織增殖的影響，以期得到生長旺盛、疏松的愈傷組織，為王棗子細胞懸浮培養體系的構建奠定初步基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

11 月從安徽淮北相山采集當年生王棗子種子，經淮北師范大學生命科學學院薛建平教授鑒定為王棗子Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan。種子去殼曬干備用。

1.2 方法

1.2.1 供試無菌苗的獲得

挑選黑褐色有花紋的飽滿的種子，用200 mg·L-1赤霉素浸泡過夜，流水下沖洗干凈，在超凈工作臺上用75%酒精處理30-60 s，用無菌水沖洗2 次，0.1%升汞溶液處理5-8 min，無菌水沖洗3-5 次，用無菌紙吸干種子表面水分放入MS 培養基中，恒溫光照培養箱內培養10 天，轉移到恒溫光照培養室內培養5 天，選擇健壯的生長狀態相同的無菌苗作為供試無菌苗。

1.2.2 培養基類型對愈傷組織誘導的影響

采用單因素完全隨機試驗設計，通過對比確定出最佳的誘導培養基類型。在超凈工作臺上將供試王棗子無菌苗的幼葉用解剖刀劃開小口子，參照段永波[30]等人的王棗子愈傷組織培養條件，將無菌苗的幼葉接入分別添加了6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)1.0 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1的B5、1/2MS和MS(添加蔗糖3%、瓊脂0.7%，調節pH 5.8-6.0)培養基中，每個試驗組6 瓶，外植體數目5-6個/瓶，培養溫度為(25±1)℃，培養濕度為70%-80%，25 天后統一計算誘導率。誘導率(%)=長出愈傷數/總接種數×100%。試驗重復3次。

1.2.3 王棗子愈傷組織增殖培養試驗

1.2.3.1 供試愈傷組織的獲得

參照段永波等[30]的王棗子組織培養條件，將王棗子供試無菌苗幼苗葉片接入1.2.2 試驗所得添加了NAA 0.5 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1（含有7 g·L-1瓊脂和30 g·L-1蔗糖，pH 5.8-6.0）的最佳基本培養基中，培養溫度為(25±1)℃，相對培養濕度為70%-80%，遮光培養25天后得到供試愈傷組織。

1.2.3.2 愈傷組織的增殖培養

采用L9(32)正交試驗設計，設置2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)濃度為0.5、1.5、2.5 mg·L-1和KT(激動素)濃度為0.2、0.5、1.0 mg·L-1，共9組試驗。將不同質量濃度的這兩種植物生長物質分別添加至試驗1.2.2 得到的最佳基本培養基中。在超凈工作臺上選取生長速度快、生長狀態佳且狀態一致的淡黃色王棗子供試愈傷組織，輕輕用鑷子捏碎并接種至含有不同組合濃度的2，4-D、KT 的培養基中，每個試驗組6 瓶，外植體數目5-6個/瓶，遮光培養，培養溫度為(25±1)℃，相對培養濕度為70%-80%，每隔幾天統計生長增殖及褐化情況，28 d后統一取樣稱量鮮重，并計算增殖倍數。增殖倍數=(28天后稱重－初始稱重)/初始稱重。試驗重復3次。

1.3 數據統計和分析

用Excel 2003 進行數據處理，SPSS 17.0 軟件進行方差分析、極差分析和Duncan分析。

2 結果與分析

2.1 基本培養基類型對王棗子愈傷組織誘導的影響

在其他培養條件均一致的條件下，三種不同類型的培養基對王棗子愈傷組織的出愈時間、誘導率和生長狀態的影響見表1。

由表1 可知，三種不同基本培養基類型對王棗子幼葉愈傷組織出愈時間和誘導率的影響差異顯著。王棗子幼葉在不同類型的培養基上均能誘導出愈傷組織。從愈傷組織的啟動時間來看，在MS、1/2MS 和B5培養基上的愈傷組織的啟動時間呈現逐漸減小的趨勢，在MS 培養基上的平均出愈時間最晚，為（7.00±1.00）天；1/2MS 培養基的平均出愈時間次之為（5.33±0.58）天，比MS 培養基的出愈時間提前了23.86%；B5培養基上最先出現幼葉傷口膨大，平均出愈時間最短為（3.67±0.58）天，比MS和1/2MS培養基的平均出愈時間分別提前了47.57%和31.14%。從王棗子幼葉愈傷組織的誘導率來看，在三種不同類型的培養基中誘導率呈現逐漸上升的趨勢，以MS 培養基上最小，為（85.56±1.11）%；1/2MS培養基的誘導率增大到（91.48±1.28）%，比MS 培養基增大了6.92%；B5培養基上愈傷的誘導率最大為（97.41±1.70）%，比1/2MS 和MS 培養基分別增大了6.48%和13.85%。從愈傷組織的形態特征來看，愈傷組織的顏色均為健康的淡黃色，其中在B5和1/2MS培養基上愈傷組織的質地較軟，MS培養基上愈傷組織的質地較硬且致密程度較大，見圖1。從愈傷組織的生長狀態來看，從MS、1/2MS 到B5培養基上愈傷組織的生長狀況呈現逐漸轉好的趨勢，B5培養基上愈傷組織的生長狀態最佳，1/2MS 培養基上次之，MS 培養基上愈傷組織的生長狀態稍差。綜合以上分析結果認為，王棗子幼葉愈傷組織的誘導以B5培養基作為基本培養基優于MS、1/2MS培養基。

2.2 植物生長物質的濃度對王棗子愈傷組織增殖培養的影響

植物生長物質的不同濃度配比對王棗子愈傷組織增殖培養的影響見表2。繼代培養時培養基中添加不同質量濃度配比的2，4-D 和KT 均能使王棗子愈傷組織出現不同程度的生長。第9 組試驗中，即2，4-D濃度為2.5 mg·L-1和KT濃度為1.0 mg·L-1時，王棗子愈傷組織増殖倍數最小為19.78 倍；第2 組試驗中2，4-D濃度為1.5 mg·L-1和KT濃度為0.2 mg·L-1時，王棗子愈傷組織増殖倍數最大，達到27.34 倍，比第9 組試驗增大了38.22%。數據的直觀分析結果顯示，增殖倍數中2，4-D 的極差為 6.02，KT 的極差為 1.83，可見 2，4-D在增殖培養中作用大于KT，即2，4-D 與KT 對王棗子愈傷組織增殖倍數影響的主次關系為2，4-D>KT。數據的方差分析結果顯示，不同質量濃度的2，4-D 對王棗子愈傷組織的增殖倍數有極顯著影響(P<0.01)，KT對王棗子愈傷組織的增殖沒有顯著影響(P=0.091)。

由表2可知，9組培養基上的愈傷組織生長狀態不一且出現了不同程度的褐化，愈傷組織在KT 濃度為0.2 mg·L-1時褐化程度普遍較嚴重，其中在第1 組試驗（2，4-D 濃度為 0.5 mg·L-1和 KT 濃度為 0.2 mg·L-1）中愈傷組織的褐化程度最嚴重、致密程度較大且生長狀態最差；第5 組試驗（2，4-D 濃度為 1.5 mg·L-1和KT 濃度為0.5 mg·L-1）中愈傷組織的褐化程度輕、較為疏松且生長狀態較好（見圖2）。

綜合極差分析和方差分析結果，王棗子疏松愈傷組織增殖培養基中選擇第5組試驗的植物生長物質濃度配比為佳的，即適合王棗子疏松愈傷組織繼代的植物生長物質濃度配比為2，4-D 1.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1。

表1 不同基本培養基類型對愈傷組織誘導的影響

圖1 不同類型基本培養基上葉片誘導的愈傷組織狀況

表2 不同濃度植物生長物質對王棗子愈傷組織增殖的影響

圖2 王棗子愈傷組織增殖培養增殖情況

3 討論

愈傷組織的狀態是植物基因型和生長環境的共同作用的結果，生長環境能在很大程度上影響愈傷組織的質地、顏色和生理狀態等[31-32]。愈傷組織的誘導和繼代是王棗子組織培養的重要內容，基本培養基中的某些組分和外源添加植物生長物質的種類以及濃度成為影響王棗子愈傷組織狀態的重要因素。

在進行植物細胞組織培養時，不同類型的培養基提供的營養、離子濃度、滲透壓和細胞生長環境也不同，培養基中各種元素的種類與含量會影響植物材料的培養效果，也是試驗成功的必要條件[33]。植物材料的不同品種一般所采用的基本培養基類型都會有所差異[34]，陳英等研究發現[35]，B5培養基在峨眉擬單性木蘭的誘導中有較好的誘導效果。本試驗中，在其他培養條件都一致的條件下，選用了MS、1/2MS、B5培養基探究對王棗子幼葉愈傷組織誘導的影響，結果發現愈傷組織的誘導率和出愈時間在三種不同類型培養基中有顯著差異，B5培養基的誘導效果最好，1/2MS培養基次之，MS 培養基的效果稍差。由此可見，基本培養基成分對王棗子愈傷組織誘導有一定影響，與前人的研究結果相符。大量研究表明，培養基中的某些成分和外源添加的植物生長物質種類以及濃度成都可起到調控作用，改變愈傷組織的質地和生長狀態等。

不同濃度配比的植物生長物質對植物疏松愈傷組織增殖培養有重要作用[36]。為了維持愈傷組織的生長狀態、保持其不分化又具有分化能力的特性，需要在繼代培養過程中調整植物生長物質的種類和使用濃度。本試驗為了獲得細胞懸浮培養所需的疏松且生長迅速的愈傷組織，探究了不同植物生長物質(2，4-D 和KT)的配比對王棗子愈傷組織繼代培養的影響，從試驗的結果來看，2，4-D和KT的不同配比對王棗子疏松愈傷組織的增殖培養有很大影響，適當濃度的2，4-D 能促進細胞的生長，在繼代培養過程中2，4-D 比KT 的影響效應大，唐麗等[37]研究紅翅槭愈傷組織繼代的過程中試驗中證明了這一點。曾超珍等[38]在研究虎杖疏松愈傷組織誘導條件時發現，2，4-D對虎杖愈傷組織增殖培養時的細胞分裂有顯著影響。程佑發等[39]在研究棗愈傷組織誘導和再生植株時發現，2，4-D對增殖培養的作用大于IBA、6-BA、NAA、IAA、ZT、2iP和KT。

本研究表明，不同培養基類型對王棗子愈傷組織的誘導有一定影響，應選擇B5培養基作為王棗子愈傷組織誘導的基本培養基；在繼代培養過程中，2，4-D對王棗子疏松愈傷組織的增殖效應影響較大。此外，本試驗中發現王棗子愈傷組織在增殖培養過程中出現不同程度的褐化狀況，可以嘗試通過添加適當的抗褐化劑和吸附劑減輕褐化現象，關于減輕增殖過程中褐化方面的研究還需深入研究。