去脂軟肝方對非酒精性脂肪性肝病大鼠模型小腸中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2B1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

張素妍， 夏恩蕊， 周青麗， 張順貞

云南中醫(yī)藥大學(xué) a.中藥學(xué)院； b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 昆明 650000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，是最常見的肝臟疾病之一，發(fā)病率逐年增加[1-3]。NAFLD的發(fā)生與代謝綜合征在中醫(yī)病因病機(jī)及體質(zhì)類型和證候特點(diǎn)上具有高度一致性[4]。小腸是物質(zhì)吸收、消化的重要部位，而且有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP) 2B1是水液代謝中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此本實(shí)驗(yàn)用去脂軟肝方對NAFLD大鼠進(jìn)行干預(yù)，探討其對NAFLD大鼠小腸組織中OATP2B1水平的影響，進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制，為相關(guān)臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 SD雄性大鼠(180～220 g)36只[購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào):SYXK(滇)K2013-0002]。去脂軟肝方(由莪術(shù)、白術(shù)、山楂、菊花、三七、青皮、蘭花參七味中藥組成)；辛伐他汀片(Merck Sharp & Dohme B.V. ，批號(hào):RO13440)。高脂飼料(88%普通飼料、10%豬油、2%膽固醇)、普通飼料均購自楚商生物有限公司。Ultrapure RNA Kit RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào):CW0581S)；SuperRT cDNA Synthesis Kit cDNA合試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào):CW0741S)；UltraSYBR Mixture(High ROX)(康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào):CW2602M)；OATP2B1抗體(PL Laboratories，批號(hào):PL0305169)；GAPDH抗體(ABCAM，批號(hào):ab181602)；HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)(Beyotime，批號(hào):A0216)；HRP-山羊抗兔IgG(H+L)(Beyotime，批號(hào):A0208)； Marker(Beyotime，批號(hào):P0066)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio，批號(hào):PC0020)；超敏ECL發(fā)光試劑盒(CLiNX，批號(hào):1810202)等。酶標(biāo)儀(BioTek，EPOCH)；熒光定量PCR儀(Heal Force，CG)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo3111)；顯微鏡(奧林巴斯CX23)；移液器(Eppendorff)；垂直板電泳裝置(Tanon VE-180PRE)；垂直板電泳膠轉(zhuǎn)膜儀裝置(Tanon VE-586)；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(CLiNX，6000 pro)等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 36只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、辛伐他汀組、去脂軟肝方高、中、低劑量組，每組各6只。正常組給予普通飼料，其余各組均給予高脂飼料造模。造模的同時(shí)預(yù)防給藥，正常組、模型組用生理鹽水灌胃(1 ml·100 g-1·d-1)，辛伐他汀組用辛伐他汀片灌胃給藥(1.8 mg·kg-1·d-1)，去脂軟肝方高、中、低劑量組分別按生藥量27.72 g·kg-1·d-1、13.86 g·kg-1·d-1、6.93 g·kg-1·d-1進(jìn)行灌胃給藥，生藥濃度分別為2.77 g/ml、1.39 g/ml、0.69 g/ml，給藥體積為1 ml·100 g-1·d-1。第14周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物，采集血清、肝臟及小腸樣本，-80 ℃保存，部分肝臟用4%多聚甲醛固定,室溫保存。

1.2.2 肝指數(shù)檢測 取材時(shí)，稱定大鼠體質(zhì)量和肝濕重，肝指數(shù)=(肝濕重/體質(zhì)量)×100%。

1.2.3 血清肝功能指標(biāo) 采用全自動(dòng)生化儀檢測大鼠ALT、AST、血糖(GLU)、血清膽固醇(CHOL)水平。

1.2.4 肝組織病理 大鼠肝臟用4%多聚甲醛固定后，常規(guī)制備肝組織石蠟切片，HE染色，顯微鏡下拍片。

1.2.5 RT-PCR法檢測小腸組織中OATP2B1 mRNA表達(dá)量 按試劑盒說明提取RNA，測定濃度和純度。利用Primer3軟件設(shè)計(jì)引物序列，由華大基因合成，以RT-PCR方法檢測目的基因的mRNA水平。

1.2.6 Western Blot檢測小腸組織中OATP2B1蛋白表達(dá)水平 取-80 ℃下保存的大鼠小腸組織，提取總蛋白后測定其濃度，每孔加40 μg總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以1% 牛血清白蛋白對膜進(jìn)行封閉40 min，再加入一抗與對照抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜后加HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL試劑曝光顯影。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由云南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：R-082018075)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理組織變化 正常組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索、肝竇分布正常，肝細(xì)胞形態(tài)一致，排列整齊有序，未見明顯變性壞死；模型組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索增寬，肝竇融合，肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)大小不一，具有大量脂肪空泡，部分區(qū)域匯管區(qū)和小葉內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞浸潤；與模型組比較，各用藥組病變明顯減輕(圖1)。

2.2 各組大鼠肝指數(shù)比較 與正常組相比，模型組肝指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，去脂軟肝方各用藥組肝指數(shù)均明顯降低(P值均<0.05);與辛伐他汀組比較，去脂軟肝方各用藥組肝指數(shù)亦均明顯降低(P值均<0.05)(表1)。

2.3 各組大鼠血清肝功能變化 與正常組相比，模型組大鼠GLU、CHOL水平均顯著升高(P值均<0.05)；與模型組相比，各用藥組均能降低GLU、CHOL水平(P值均<0.05)(表2)。

表1 各組大鼠肝指數(shù)的比較

表2 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)的比較

注:a,正常組；b，模型組；c，辛伐他汀組；d，去脂軟肝方高劑量組；e，去脂軟肝方中劑量組；f，去脂軟肝方低劑量組。

2.4 各組大鼠小腸組織OATP2B1 mRNA表達(dá)情況 與正常組相比，模型組OATP2B1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，辛伐他汀組和去脂軟肝方高、中劑量組OATP2B1 mRNA表達(dá)均顯著降低(P值均<0.05)；與辛伐他汀組比較，去脂軟肝方中、低劑量組OATP2B1 mRNA表達(dá)均顯著降低(P值均<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠小腸組織OATP2B1 mRNA相對表達(dá)水平比較

2.5 各組大鼠小腸組織OATP2B1蛋白表達(dá)情況 與正常組相比，模型組OATP2B1蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，各用藥組OATP2B1蛋白表達(dá)均顯著降低(P值均<0.05)；與辛伐他汀組比較，去脂軟肝方高、中、低劑量組OATP2B1蛋白表達(dá)均顯著降低(P值均<0.05)(圖2,表4)。

3 討論

NAFLD歸屬于中醫(yī)“脅痛”“積聚”“痞證”“肝脹”“肝癖”“肥氣”等范疇[5-7]，中醫(yī)認(rèn)為肝脾相關(guān)，肝屬木，脾屬土，兩者生理上相關(guān)，主要表現(xiàn)為肝主疏泄和脾主運(yùn)化功能之間的相互促進(jìn)，以及肝藏血與脾統(tǒng)血之間的相互配合，共同在人體的消化、吸收、血液運(yùn)行及水液代謝過程中發(fā)揮重要作用。 其中肝脾二臟在飲食消化吸收方面的相關(guān)最為重要，膳食營養(yǎng)攝入影響NAFLD的發(fā)生與發(fā)展過程[8]，過食肥甘，導(dǎo)致脾失健運(yùn)[9]，水谷精微不化，水濕內(nèi)停，凝結(jié)成痰，痰阻氣機(jī)，氣機(jī)升降失調(diào)，水濕不化，久而傷肝[10]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“腸”的功能屬于中醫(yī)“脾”的功能已毋庸質(zhì)疑，因此，肝脾相關(guān)亦可表現(xiàn)為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中肝臟與腸道在生理病理上的相關(guān)性?！靶∧c者，受盛之官，化物出焉”，小腸與脾共主運(yùn)化而各司其職，與機(jī)體代謝同樣十分密切[9,11]。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽家族是重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)大量體內(nèi)外化合物的吸收，相關(guān)研究證明OATP的異常表達(dá)，與脾虛[12-13]、肝癌[14]、NAFLD[15]等多種疾病密切相關(guān)，OATP2B1作為OATP家族中重要的一員，在機(jī)體大部分器官都有表達(dá)，介導(dǎo)許多藥物和內(nèi)源性化合物的肝和腸吸收[16]，而小腸作為消化、吸收的重要部位，與OATP2B1的關(guān)系不容忽視。

注：1～6分別為正常組、模型組、辛伐他汀組、去脂軟肝方高、中、低劑量組。

表4 各組大鼠小腸組織OATP2B1蛋白相對表達(dá)水平比較

去脂軟肝方為云南省肝病專家、榮譽(yù)名中醫(yī)蘇漣教授的經(jīng)驗(yàn)方，由莪術(shù)、白術(shù)、山楂、菊花等七味中藥組成，具有柔肝健脾、理氣活血的功效。本課題組前期研究證明，在該方的基礎(chǔ)上加減治療脂肪肝在臨床上具有很好的治療效果，同時(shí)去脂軟肝方能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠血脂、肝脂及肝組織脂肪變性及血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)[17]，NAFLD的病變與OATP2B1在不同器官的表達(dá)有密切聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食造模14周，用去脂軟肝方進(jìn)行干預(yù)治療后，去脂軟肝方能夠通過降低大鼠肝指數(shù)、GLU、CHOL水平改善NAFLD病變。NAFLD大鼠小腸組織中OATP2B1 mRNA和蛋白表達(dá)相對于正常組明顯上調(diào)，使用去脂軟肝方干預(yù)治療后，能夠顯著下調(diào)OATP2B1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。長期高脂飲食刺激，機(jī)體產(chǎn)生大量的“痰濕”，機(jī)體可能通過上調(diào)OATP2B1的表達(dá)，對這些異物進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，最終維持機(jī)體動(dòng)態(tài)平衡，但是由于長期的過度刺激，OATP2B1過表達(dá)后，對這些生物體異物進(jìn)行大量轉(zhuǎn)運(yùn)而機(jī)體不能及時(shí)將這些物質(zhì)快速代謝或排泄，從而引起水液的代謝障礙。筆者認(rèn)為去脂軟肝方可能通過降低OATP2B1的表達(dá)，減緩NAFLD的病變程度，但是其作用機(jī)理需要進(jìn)一步探討。

利益沖突聲明：本研究不存在與研究者、倫理委員會(huì)成員以及公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：張素妍負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；夏恩蕊、周青麗參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；張順貞負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。