HBcAg特異性輔助性T淋巴細胞22在HBV感染者中的變化和意義

靳 娟， 黃小正， 靖新艷， 張 媛， 尹金玲， 李佳佳， 王思思， 郭雅玲， 李 瑛

西安市第八醫院 a.抗病毒門診； b.醫務科； c.肝病科， 西安 710061

HBV感染的臨床結局與機體的免疫狀態密切相關，且依賴于病毒復制[1]。急性乙型肝炎(acute hepatitis B, AHB)患者細胞免疫應答增強，細胞毒性T淋巴細胞在發揮直接殺傷作用的同時，可分泌大量IFNγ及TNFα等炎性細胞因子，可清除病毒感染，亦可誘導肝臟炎癥損傷。慢性乙型肝炎(CHB)則因存在機體免疫功能不全或衰竭，不能有效清除病毒，導致感染慢性化[2]。輔助性T淋巴細胞(Th)22是一類新發現的CD4+T淋巴細胞亞群，主要分泌IL-22，芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)是調控Th22細胞分化的主要轉錄因子[3]。Th22細胞參與了HBV的發病過程，但病毒特異性Th22細胞在HBV免疫發病中的作用尚未完全闡明。因此，本研究觀察了AHB和CHB患者中HBcAg特異性Th22細胞的變化，以期初步闡釋病毒特異性輔助性T淋巴細胞亞群在HBV感染免疫發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年3月-2019年3月在本院就診的乙型肝炎患者(包括AHB患者和CHB患者)。AHB患者診斷標準：(1)既往無乙型肝炎病史，HBsAg陰性；(2)當次檢查HBsAg陽性，HBV DNA陽性；(3)抗-HBc-IgM陽性；(4)ALT>10倍正常值上限。CHB患者診斷標準符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[4]中的診斷標準：(1)HBsAg陽性且HBV DNA陽性超過6個月；(2)ALT>2倍正常值上限。排除標準：(1)年齡<18歲或>65歲；(2)既往曾接收IFN和/或核苷(核苷酸)類似物抗病毒治療；(3)合并其他肝炎病毒或HIV感染；(4)合并自身免疫性疾病；(5)合并惡性腫瘤；(6)妊娠期和哺乳期婦女。AHB患者均未接受抗病毒治療，僅給予保肝、退黃、降酶等對癥支持治療，分別于基線和6個月后隨訪采集外周血。CHB患者均接受富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(TDF，葛蘭素史克制藥)300 mg/d抗病毒治療，分別于基線和治療6、12個月后隨訪采集外周血。選擇同時期在本院進行健康查體的抗-HBs陰性的志愿者作為健康對照(HC)。

1.2 方法

1.2.1 血漿和外周血單個核細胞(PBMC)的分離 采集EDTA抗凝外周血10 ml，于1000 r/min離心10 min，收集上層血漿凍存備用。下層血細胞使用北京索萊寶公司的Ficoll人淋巴細胞分離液、采用密度梯度離心法分離PBMC，凍存備用。

1.2.2 流式細胞術檢測Th22細胞 復蘇PBMC，加入RPMI1640和10%胎牛血清，在24孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養，每位志愿者的PBMC設立2個復孔，每孔106個PBMC。其中一孔加入佛波酯(50 μg/ml)、伊烏諾霉素(1 μg/ml)刺激培養6 h，同時加入莫能霉素(10 μg/ml)抑制分泌。另一孔加入重組HBcAg(以色列ProSpec公司，2 μg/ml)刺激培養12 h，同時加入莫能霉素(10 μg/ml)抑制分泌。收集刺激培養的細胞，PBS洗滌2次，加入CD3-PerCP(美國BD Bioscience公司)和CD4-APC(美國eBioscience公司)，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次后加入破膜固定液A，4 ℃避光孵育15 min，PBS洗滌2次后加入破膜固定液B，同時加入IL-22-PE(美國eBioscience公司)，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗滌2次后加入4%多聚甲醛固定。使用FACS Calibur流式細胞儀分析，使用FlowJo V10軟件分析流式結果。

1.2.3 ELISA檢測IL-22水平 IL-22 ELISA檢測試劑盒購自美國eBioscience公司，操作按說明書進行。向每孔中加入50 μl樣本稀釋液，然后向每孔中加入50 μl標準品和血漿樣本，混勻后室溫孵育2 h。洗板5次，每孔中加入100 μl辣根過氧化物酶標記的氯霉素結合物，室溫孵育2 h。洗板5次，每孔中加入100 μl底物溶液，室溫避光孵育30 min，加入100 μl終止液。立即讀取OD450nm，繪制標準曲線，計算血漿樣本中IL-22的濃度。

1.2.4 實時定量PCR檢測AhR mRNA水平 每位志愿者取106個PBMC，使用美國Invitrogen公司的Trizol試劑提取總RNA，使用NanoDrop對RNA進行定量。取1 μg總RNA，使用TaKaRa公司的PrimeScript反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄反應體系：5×PrimeScript Buffer (for Real Time) 2 μl、PrimeScript RT Enzyme Mi×10.5 μl、Oligo dT Primer (50 μmol/L) 0.5 μl、Random 6 mers (100 μmol/L) 0.5 μl、總RNA 1 μg、加入RNase Free dH2O至10 μl。反轉錄反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。使用TaKaRa公司的TB Green Premix Ex Taq Ⅱ進行實時定量PCR反應，實時定量PCR反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2×) 10 μl、PCR上游引物(10 μmol/L) 0.8 μl、PCR下游引物(10 μmol/L) 0.8 μl、ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μl、RT反應液(cDNA溶液)2 μl、dH2O 6 μl，總體積為20 μl。實時定量PCR反應條件：預變性 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，

40個循環。使用美國Applied Biosystems公司的ABI7500實時定量PCR儀進行PCR反應，引物序列參考文獻[5]合成，采用2-ΔΔCT法對目的基因進行半定量分析。

1.3 倫理學審查 本研究方案通過西安市第八醫院倫理委員會批準(EHEC-2018-01-008)，符合《赫爾辛基宣言》倫理要求，入組志愿者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 共入組AHB患者11例，CHB患者38例，HC 16例。3組研究對象在性別比例和年齡的差異無統計學意義，AHB患者和CHB患者在HBV DNA、HBeAg陽性率之間的差異亦無統計學意義。入組志愿者的一般資料見表1。

2.2 3組患者的非特異性和HBcAg特異性Th22細胞、血漿IL-22、AhR mRNA的變化 根據前向角散射和側向角散射對淋巴細胞圈門，選擇淋巴細胞中CD3+CD4+細胞，檢測CD3+CD4+細胞中分泌IL-22的細胞，即為Th22細胞(CD3+CD4+IL-22+)，佛波酯和伊烏諾霉素刺激產生的非特異性Th22細胞和HBcAg刺激產生的特異性Th22細胞的典型流式分析圖見圖1。AHB患者非特異性Th22細胞比例(2.86%±0.45%)高于CHB患者(1.39%±0.33%)和HC(0.80%±0.13%)，差異均有統計學意義(t值分別為11.80、17.30，P值均<0.001)，CHB患者非特異性Th22細胞比例亦高于HC(t=6.825，P<0.001)。HC中不存在HBcAg特異性Th22細胞，AHB患者HBcAg特異性Th22細胞比例高于CHB患者(2.97%±0.52% vs1.22%±0.22%，t=16.58，P<0.001)(圖2)。AHB患者血漿IL-22水平[(130.7±39.97)pg/ml]高于CHB患者[(66.59±20.83)pg/ml]和HC[(50.63±11.07)pg/ml]，差異均有統計學意義(t值分別為7.176、7.662，P值均<0.001)，CHB患者血漿IL-22水平亦高于HC(t=2.887，P=0.006)。AHB患者PBMC中AhR mRNA(11.45±3.03)高于CHB患者(4.81±1.25)和HC(1.10±0.17)，差異均有統計學意義(t值分別為10.85、13.75，P值均<0.001)，CHB患者AhR mRNA亦高于HC(t=11.77，P<0.001)(圖2)。

表1 入組志愿者的一般資料

2.3 非特異性和HBcAg特異性Th22細胞、血漿IL-22、AhR mRNA與HBV DNA和ALT的相關性分析 在AHB患者和CHB患者中，非特異性Th22細胞比例、HBcAg特異性Th22細胞比例、血漿IL-22和AhR mRNA水平與HBV DNA均無顯著相關性(P值均>0.05)，非特異性Th22細胞比例、AhR mRNA水平與ALT無顯著相關性(P值均>0.05)。而HBcAg特異性Th22細胞比例在AHB患者和CHB患者中均與ALT水平呈顯著正相關(r值分別為0.638、0.830，P值分別為0.035、0.002)，血漿IL-22水平在AHB患者和CHB患者中亦均與ALT水平呈顯著正相關(r值分別為0.552、0.431，P值分別為0.001、0.007)。

2.4 AHB患者恢復期非特異性和HBcAg特異性Th22細胞、血漿IL-22、AhR mRNA的變化 AHB患者出院6個月后隨訪觀察，11例AHB患者出院6個月后HBV DNA和HBsAg陰轉，7例患者ALT水平復常，4例患者ALT水平輕度升高(均未超過2倍正常值上限)。非特異性Th22細胞比例在6個月后與基線比較差異無統計學意義(2.81%±0.47% vs 2.86%±0.45%，t=0.399，P=0.698)，HBcAg特異性Th22細胞比例在6個月后較基線顯著降低(2.79%±0.56% vs 2.97%±0.52%，t=3.055，P=0.012)，血漿IL-22水平在6個月后亦較基線顯著降低[(105.8±25.23)pg/ml vs (130.7±39.97)pg/ml，t=2.362，P=0.040]，而AhR mRNA水平在6個月后和基線比較差異無統計學意義(11.86±1.54 vs 11.45±3.03，t=0.415，P=0.687)(圖3)。

圖1 非特異性Th22細胞和HBcAg特異性Th22細胞的典型流式分析

圖2 3組中非特異性Th22、HBcAg特異性Th22、血漿IL-22、AhR mRNA的比較

圖3 AHB患者6個月后非特異性Th22、HBcAg特異性Th22、血漿IL-22、AhR mRNA與基線比較的變化

2.5 TDF治療對CHB患者非特異性和HBcAg特異性Th22細胞、血漿IL-22、AhR mRNA的影響 所有CHB患者均接受TDF抗病毒治療，分別于治療6個月和12個月時進行隨訪。治療6個月時，所有患者HBV DNA均低于檢測值下限，達到病毒學應答，29例患者ALT水平復常，23例HBeAg陽性患者中2例患者實現HBeAg陰轉，但未發生HBeAg血清學轉換。治療12個月時，所有患者HBV DNA仍低于檢測值下限，33例患者ALT水平復常，23例患者中5例患者實現HBeAg陰轉，1例患者發生HBeAg血清學轉換，無患者發生HBsAg陰轉。非特異性Th22細胞比例在基線(1.39%±0.33%)、治療6個月(1.30%±0.27%)、治療12個月(1.31%±0.18%)比較差異無統計學意義(F=1.454，P=0.238)，HBcAg特異性Th22細胞比例在治療6個月(1.13%±0.16%)和治療12個月(1.11%±0.15%)均顯著低于基線(1.22%±0.22%)(t值分別為4.353、3.927，P值均<0.001)，但在治療6、12個月HBcAg特異性Th22細胞比例的差異無統計學意義(t=1.440，P=0.158)，血漿IL-22水平在治療6個月(54.95±10.07)pg/ml和治療12個月(52.23±8.17)pg/ml均顯著低于基線[(66.59±20.83)pg/ml](t值分別為4.426、4.810，P值均<0.001)，但在治療6、12個月IL-22水平的差異無統計學意義(t=1.786，P=0.082)，而AhR mRNA水平在基線(4.81±1.25)、治療6個月(5.01±1.14)、治療12個月(4.97±0.99)比較差異無統計學意義(F=0.360，P=0.737)(圖4)。

圖4 CHB患者接受TDF治療6個月和12個月后非特異性Th22、HBcAg特異性Th22、血漿IL-22、AhR mRNA與基線比較的變化

3 討論

Th22主要分泌IL-22，根據細胞因子發揮作用的微環境及不同疾病誘導機體免疫應答的差異，IL-22具有促進免疫炎癥應答和免疫保護的雙重功能[6]。因此，Th22也是具有雙重功能的效應性CD4+T淋巴細胞亞群。但是，IL-22在HBV感染中所發揮的作用尚存在爭議。IL-22和分泌IL-22的CD4+T淋巴細胞在HBV感染者中的水平升高[7]。雖然IL-22不具備直接抗病毒效應[8]，但重組IL-22可募集多種炎性細胞和炎性介質進入肝臟，誘導HBV感染小鼠模型和CHB患者肝臟炎癥損傷[9-10]。也有研究[11]發現，在HBV感染小鼠模型和CHB患者中，IL-22均可促進肝臟干細胞的增殖，促進肝細胞再生，對病毒感染誘導的肝細胞損傷進行修復。本研究發現， HBV感染者外周血中Th22(非特異性和HBcAg特異性)、IL-22、轉錄因子AhR水平均顯著高于HC，而AHB患者中Th22細胞、IL-22和AhR水平亦高于CHB。上述研究結果與在HBV感染所致的慢加急性肝衰竭[12]和慢性丙型肝炎[13]中的發現一致，提示Th22參與了HBV的發病。本研究亦發現，Th22、IL-22和AhR與HBV復制無關，進一步說明IL-22抗病毒活性較弱，更為重要的是，無論在AHB還是CHB患者中，HBcAg特異性Th22和血漿IL-22水平均與ALT水平呈顯著正相關，提示IL-22主要與患者肝臟炎癥損傷相關。由于IL-22主要由免疫細胞分泌，作用的靶細胞主要是包括肝細胞在內的多種實質細胞[14-15]，因此，推測HBV感染可能誘導CD4+T淋巴細胞分泌IL-22增多，病毒特異性Th22水平升高，而升高表達的IL-22進一步作用于肝細胞，誘導肝細胞壞死和凋亡，導致肝臟炎癥損傷，促進疾病進程。

有效的抗病毒治療不但可抑制HBV復制，還可調控機體免疫應答，打破免疫耐受，增強機體免疫系統的抗病毒效應[16]。急性HBV感染屬自限性疾病，95%以上的患者可實現病毒自發清除，無需進行抗病毒治療，6個月后可實現HBV DNA陰轉和HBsAg清除。本研究發現，AHB患者在出院6個月后，非特異性Th22和AhR水平與基線比較未見明顯變化，但HBcAg特異性Th22和IL-22水平則明顯降低。而CHB患者接受TDF抗病毒治療后也有相似的發現，HBcAg特異性Th22和外周血IL-22水平在CHB患者實現病毒學和血清學應答后顯著下降。這與既往替比夫定片治療CHB患者過程中IL-22水平降低的發現[17]一致。但HBcAg特異性Th22和IL-22水平與HBV DNA水平無顯著相關性，提示上述指標的變化可能與病毒復制抑制無關。由于HBcAg特異性Th22主要與肝臟炎癥損傷相關，而在HBV感染病情恢復的過程中，非特異性Th22水平未發生明顯變化，而HBcAg特異性Th22和IL-22水平顯著降低，提示HBV感染者外周血中升高表達IL-22可能主要來源于病毒特異性Th22，而非特異性Th22在HBV感染的免疫和炎癥應答中的作用尚不明確，仍需進一步研究證實。

綜上所述，HBcAg特異性Th22及其分泌的IL-22與HBV感染炎癥應答密切相關，可能通過誘導肝細胞損傷，發揮促進肝臟免疫炎癥損傷的作用。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：靳娟、靖新艷、張媛負責實驗操作，數據分析，論文撰寫；黃小正、尹金玲、李佳佳、王思思負責收集數據，修改論文；李瑛、郭雅玲負責課題設計，資料分析，擬定寫作思路，指導撰寫論文并最后定稿。