堿性條件下生物修復吡啶污染菌株的篩選及表征

翟 赟，劉建忠，易紅磊，周 衛，陳 俊，黃 皓，秦曉蓉

(武漢科技大學化學與化工學院，湖北 武漢 430081)

吡啶是一種重要的工業生產原料，也是一種危害性極大的環境污染物。吡啶及其衍生物的用途非常廣泛[1]，現代工業生產每天都會產生數以百萬噸的含吡啶及其衍生物的工業污水。吡啶及其衍生物具有致畸性，也是潛在的致癌物[2]，若長期暴露在含吡啶環境中會出現身體不適甚至患上疾病[3]。目前，對含吡啶及其衍生物污水的處理方法有物理化學法[4-6]和微生物法，物理化學法存在運作成本高、產生二次污染等缺點[7]；而微生物法具有環境友好、運作成本較低、可有效避免二次污染等優點。Stobdan等[8]報道了一株戈登氏菌屬菌株，該菌株能在192 h內將初始濃度為5 537 mg·L-1的吡啶完全降解，這是至今報道的微生物可降解吡啶的最高濃度；Bai等[9]和Shen等[10]報道的可降解吡啶的初始濃度分別為2 614 mg·L-1和2 600 mg·L-1；更多的報道在1 000 mg·L-1以下[11-12]，且對pH值的適用范圍較窄，多為中性或略偏堿性。

為篩選能在極端pH值環境下有效降解吡啶的菌株，將其用于吡啶污染的原位生物修復，作者以吡啶為唯一碳源和氮源，從某焦化廠污水處理系統中篩選吡啶高效降解菌株，檢測其生理生化特征，鑒定其分類學地位，并研究其在堿性條件下對吡啶的降解效果。

1 實驗

1.1 材料、試劑與培養基

活性污泥，采自某焦化廠污水處理系統。

吡啶儲存液(1×105mg·L-1)，抽濾滅菌后儲存于已滅菌和干燥的棕色試劑瓶中，備用；其余試劑均為分析純，購自武漢市各藥品經銷商。

富集培養基(LB)，pH值為7.0～7.2(以2 mol·L-1NaOH溶液調節)，121 ℃高壓滅菌15 min；無機鹽培養基(MSM)，參照文獻[13]方法配制，pH值為8.0～11.0(以NaOH儲存液調節)，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 菌株的篩選

取適量的活性污泥樣品，攪拌均勻，接入經高壓滅菌處理的LB培養基中，于35 ℃、150 r·min-1振蕩培養48 h；采用逐步提高吡啶濃度的方法對富集培養液中的菌群馴化3輪；取1 mL馴化培養液，用磷酸鹽緩沖液梯度稀釋后涂布吡啶濃度為500 mg·L-1的MSM瓊脂平板，于35 ℃培養箱中培養，選取色澤、形態存在差異的菌落進行劃線純化。

1.3 菌落的形態、生理生化特征及分子生物學鑒定

菌落的形態特征采用裸眼觀察，用游標卡尺測定一定數目菌落的直徑，統計菌落的大小范圍。

采用標準的操作程序完成革蘭氏和芽孢染色，于顯微鏡下放大100倍觀察染色結果；其它生理生化特征的測定參照文獻[13]方法進行，包括V-P試驗、淀粉水解試驗和尿酶試驗等。

使用BLAST軟件對NCBI數據庫中的16S rRNA核苷酸序列進行搜索，應用ClustalW算法進行逐對和多重序列比對，以核苷酸序列同源性作為初步判斷菌株種屬的依據。

1.4 堿性條件下菌株降解吡啶實驗

1.4.1 種子液的制備

將1 mL馴化培養液接入吡啶初始濃度為1 000 mg·L-1的MSM培養基中，直到對數生長晚期。將培養液移入50 mL離心管，離心回收菌體；以適量不含吡啶的MSM培養基重懸沉淀，離心回收菌體；再以適量不含吡啶的MSM培養基重懸沉淀，并將懸液的OD600值調至1.0，作為種子液。

1.4.2 吡啶降解實驗

在MSM培養基初始pH值分別為8.0、10.0和11.0時，考察菌株對不同初始濃度(300 mg·L-1、500 mg·L-1、700 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 400 mg·L-1、1 600 mg·L-1、1 800 mg·L-1、2 500 mg·L-1)吡啶的降解效果。培養液總體積為100 mL，吡啶按設計要求由儲存液經稀釋后加入，種子液的接入量為5 mL，培養溫度為35 ℃，搖床轉速為150 r·min-1，每隔12 h取一次樣，采用比色法測定吡啶濃度(256 nm)及菌體生物量(600 nm)，計算吡啶降解率及菌體生物量。每組實驗設3個平行。

2 結果與討論

2.1 吡啶降解菌株的篩選

經過數周的富集、馴化和分離，得到13株能以吡啶為唯一碳源和氮源生長的菌株。經過搖瓶初步降解實驗，編號為Py-5的菌株表現出突出的吡啶降解能力，將其命名為WUST-py。

2.2 吡啶降解菌株的表征

菌株WUST-py于35 ℃培養3 d后的菌落呈球形，表面光滑，邊緣整齊，中間凸起，呈橘黃色，菌體不透明，直徑為0.5～2.0 mm。

菌株WUST-py革蘭氏染色、H2S以及尿酶試驗的結果均呈陽性，能夠利用葡萄糖；而甲基紅、檸檬酸、V-P試驗、吲哚試驗以及淀粉水解試驗的結果均呈陰性，不能利用蔗糖；能形成芽孢。

菌株WUST-py的16S rRNA基因部分核苷酸序列 (1 393 bp) 由武漢擎科創新生物技術有限公司測定，已成功提交到GenBank，接收號為KY658456。采用BLAST軟件將該序列與提交到GenBank中其它菌株該基因序列進行同源性比對。結果表明，菌株WUST-py與紅球菌屬(Rhodococcussp.)菌株D-50和WB1的同源性均高達99%，故將該菌株鑒定為紅球菌屬。

2.3 吡啶降解菌株在堿性條件下對吡啶的降解效果

2.3.1 初始pH值為8.0時的降解效果

在MSM培養基初始pH值為8.0時，菌株WUST-py對不同初始濃度吡啶的降解效果如圖1所示。

1～6，吡啶初始濃度(mg·L-1)：500、1 000、1 400、1 600、1 800、2 500

由圖1a可知，在MSM培養基初始pH值為8.0時，菌株WUST-py分別在60 h、72 h、96 h、96 h和108 h內將初始濃度分別為500 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 400 mg·L-1、1 600 mg·L-1和1 800 mg·L-1的吡啶降解至檢測不出的水平，1 800 mg·L-1是菌株WUST-py能夠完全降解吡啶的最高濃度；當吡啶初始濃度高達2 500 mg·L-1時，菌株WUST-py對吡啶基本沒有降解作用。培養液中吡啶的減少很大程度上是由于吡啶的揮發所致。

由圖1b可知，在MSM培養基初始pH值為8.0時，菌株WUST-py對不同初始濃度吡啶的降解均出現明顯的生長延滯期(24～48 h)，且隨吡啶初始濃度的增大，生長延滯期逐漸延長，這是由吡啶抑制性底物的化學本質決定的。而且由于吡啶環上引入N原子，更提高了其穩定性和抗降解性，所以微生物降解吡啶時的生長延滯期明顯長于微生物降解苯酚時的生長延滯期。

2.3.2 初始pH值為10.0時的降解效果

在MSM培養基初始pH值為10.0時，菌株WUST-py對不同初始濃度吡啶的降解效果如圖2所示。

1～6，吡啶初始濃度(mg·L-1)：500、1 000、1 400、1 600、1 800、2 500

由圖2a可知，與MSM培養基初始pH值為8.0時的降解曲線相比較，菌株WUST-py在初始pH值為10.0時完全降解初始濃度為500 mg·L-1和1 400 mg·L-1的吡啶所需時間完全相同，均分別為60 h和96 h，但完全降解初始濃度為1 000 mg·L-1、1 600 mg·L-1、1 800 mg·L-1的吡啶所需時間則均延長了12 h。

比較圖1b和圖2b，并不能得出MSM培養基初始pH值的增大會導致菌株WUST-py生長延滯期延長的結論，在很大程度上菌株WUST-py在MSM培養基初始pH值為8.0和10.0時表現出的生長延滯期是一致的。

Mathur等[3]報道，在初始pH值為10.0時，菌株S.putrefaciens和B.sphaericus在150 h內對100 mg·L-1吡啶的降解率分別為40%和25%。菌株WUST-py在MSM培養基初始pH值為10.0時對吡啶的降解能力遠高于文獻報道的兩株菌株。

2.3.3 初始pH值為11.0時的降解效果

考慮到堿性增強對微生物活性的影響較大，在進行降解實驗時有意降低了吡啶的初始濃度，旨在驗證菌株WUST-py在較強堿性條件下降解吡啶的潛力。在MSM培養基初始pH值為11.0時，菌株WUST-py對不同初始濃度吡啶的降解效果如圖3所示。

1～6，吡啶初始濃度(mg·L-1)：300、500、700、1 000、1 600、2 500

由圖3a可知，當MSM培養基初始pH值為11.0時，菌株WUST-py分別在36 h、48 h、60 h、72 h、108 h內將初始濃度分別為300 mg·L-1、500 mg·L-1、700 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 600 mg·L-1的吡啶完全降解。MSM培養基初始pH值為11.0時，菌株完全降解500 mg·L-1吡啶所需的時間短于MSM培養基初始pH值為8.0和10.0時的，菌株完全降解1 000 mg·L-1吡啶所需的時間短于MSM培養基初始pH值為10.0時的，與MSM培養基初始pH值為11.0時的時間完全相同，很大程度上是由于不同批次種子液之間菌體活力的差異所造成的。

由圖3b可知，MSM培養基初始pH值增大至11.0并沒有顯著延長菌株的生長延滯期。

Mathur等[3]報道，在初始 pH 值為 11.0 時，菌株S.putrefaciens和B.sphaericus在 150 h 內對 100 mg·L-1吡啶的降解率小于20%。菌株WUST-py在堿性條件下降解吡啶的機理有待于深入研究，初步推斷菌株WUST-py是一株產酸菌，能在降解吡啶的過程中產生大量的有機酸，并以此中和培養液中的堿，從而緩解了堿性條件對菌株生長強烈的抑制作用，有利于菌株的生長和對吡啶的降解。

菌株WUST-py降解吡啶的理想pH值為8.0，與文獻[14-15]報道的中性或偏堿性(pH值7～8)是微生物降解吡啶的理想pH值一致，所不同的是菌株WUST-py對初始pH值不敏感，MSM培養基初始pH值的增大，只是讓降解時間稍微延長，或者降解吡啶的最高濃度稍微降低。

3 結論

從某焦化廠污水處理系統曝氣池中篩選得到一株吡啶高效降解菌株，將其命名為WUST-py。該菌株為革蘭氏陽性菌且有芽孢，經16S rRNA基因核苷酸序列同源性比對，鑒定為紅球菌屬(Rhodococcussp.)。在35 ℃、150 r·min-1條件下，當MSM培養基初始pH值為8.0時，該菌株能在108 h內將初始濃度為1 800 mg·L-1的吡啶完全降解；當MSM培養基初始pH值為10.0時，該菌株能在120 h內將初始濃度為1 800 mg·L-1的吡啶完全降解；當MSM培養基初始pH值為11.0時，該菌株依然能夠在108 h內將初始濃度為1 600 mg·L-1的吡啶完全降解。該菌株在用于堿性條件下吡啶污染區域的原位生物修復中具有明顯的優勢和較大的應用潛力。