臥龍自然保護區野生動物腸道寄生蟲感染情況調查

何廷美 ，陳善瑜，施小剛，柴宜均，陳禮穎，許佳雪，程躍鴻，彭廣能*

（1.四川臥龍國家級自然保護區管理局，四川汶川 623006；2.四川農業大學動物醫學院，四川成都 611130）

四川臥龍自然保護區是國家級第三大自然保護區，珍稀動植物繁多，享有“熊貓之鄉”“寶貴的生物基因庫”“天然動植物園”等美名。保護區內國家一級重點保護野生動物有15種，二級重點保護野生動物有53 種［1］。越來越多的研究顯示寄生蟲病是危害野生動物的主要疾病之一［2］，某些人獸共患的寄生蟲病還會給人類健康帶來威脅。動物腸道內常見的寄生蟲主要有絳蟲、吸蟲、線蟲和原蟲，以及一些蟲體微小的原蟲，如芽囊原蟲（Blastocystis sp.）。近期有研究發現，珍稀野生動物在感染芽囊原蟲過程中具有人畜共患的風險［2］。本研究調查了四川臥龍自然保護區內包括野生大熊貓、小熊貓、豹貓在內的12 種珍稀野生動物腸道寄生蟲的感染情況，旨在豐富保護區野生動物腸道寄生蟲感染的本底資料，同時做好潛在人獸共患病的風險評估。

1 調查對象

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）、小熊貓（Ailurus fulgens）、豹貓（Prionailurus bengalensis）、羚牛（Budorcas taxicolor）、豬獾（Arctonyx collaris）、藏酋猴（Macaca thibetana）、林麝（Moschus berezovskii）、豪豬（Hystrix hodgsoni）、中華鬣羚（Capricornissumatraensis）、毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）、中華斑羚（Naemorhedus griseus）、水鹿（Rusa unicolor）12種野生動物。

2 動物糞便樣本的采集

2020 年4 月～5 月，四川臥龍自然保護區巡山工作人員在保護區內不同地理位置和海拔使用一次性自封袋采集動物糞便（糞便排出體外的時間控制在3 d以內），體型較大的大動物采集50～100 g 糞便，小動物采集10～20 g 糞便，編號記錄動物種類、采集地區、采集時間，低溫保存送四川農業大學實驗室檢查。

3 方法

3.1 主要溶液及配制方法

3.1.1 飽和食鹽水 用電子秤稱取500g NaCl置于320 mL蒸餾水中，然后緩慢加熱使其完全溶解，冷卻后裝于500mL容量瓶中，4℃冰箱儲存待用。

3.1.2 2.5%重鉻酸鉀溶液 先稱取2.5 g K2Cr2O7，然后將其溶解于100 mL ddH2O 中，常溫密閉保存。

3.1.3 1%瓊脂糖凝膠 天平稱取瓊脂糖粉1.2 g，溶解于120 mL 1倍TBE溶液中，微波爐高火加熱至沸騰后，小火加熱至澄清，取出冷卻至不燙手，滴加GoldView染液10 μL，用玻棒攪拌，并倒入制膠板中，冷卻凝固后置于電泳槽中備用。

3.2 蟲卵檢查方法

3.2.1 飽和鹽水漂浮法 取被檢糞便10 g 左右，放入100 mL燒杯內，加飽和鹽水至40 mL，將糞便攪碎、充分混勻，經分樣篩過濾，將濾液倒入2 mL離心管中，使液面凸出瓶口呈半球形，靜置30min，用載玻片剛好觸碰到液面（以蘸取漂浮在液面上的蟲卵），然后蓋上蓋玻片，置顯微鏡下檢查。

3.2.2 沉淀法 取備檢糞便10 g 左右，放入燒杯內，加入清水至40 mL，將糞便攪碎、充分混勻，經分樣篩過濾，將濾液倒入燒杯中，靜置30 min，倒去上清液，如此反復操作3～4 次，最后棄上層液體取沉淀物涂布于載玻片上，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下檢查。

3.2.3 蟲卵鑒定 根據檢出蟲卵、卵囊的顏色、形態、大小等特征，參考相關專業書籍、文獻進行分類、鑒定［3-5］。

3.3 糞便基因組DNA 的提取 每份糞便取200～300 mg置于2 mL離心管中，加入蒸餾水，混勻，12 000 r/min離心1 min，棄上清，重復上述步驟直至清洗干凈表面的重鉻酸鉀得到清亮透明的液體。隨后按照E.Z.N.A.?Stool DNA Kit糞便全基因組提取試劑盒（Omega Biotek Inc D4015-01，USA）說明書的操作步驟提取DNA，操作完成后將DNA放于-20 ℃冰箱中待檢。

3.4 PCR 擴增及測序 基于芽囊原蟲SSU rRNA基因位點對所提取的DNA 樣品進行PCR 擴增。根據文獻［6］給出的引物和NCBI中的基因序列來設置引物、反應條件與反應體系。

3.4.1 引物 所需合成的引物序列及產物DNA片段大小見表1。

表1 芽囊原蟲PCR引物

3.4.2 反應體系 PCR擴增反應體系為25 μL，見表2。

表2 PCR反應體系

PCR 擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；93 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環30 次；72 ℃再延伸3 min；10 ℃永久保存。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海生工生物技術有限公司進行單向測序。

3.5 SSU rRNA序列分析及種系發育分析 測序后的序列在NCBI 的Blast 上進行相似性比對，將所獲得的序列與GenBank 上同源性最高的序列進行比較，確定序列是否是芽囊原蟲的基因組，分析序列差異確定亞型。利用Mega7.0 軟件，選擇鄰接法（Neighbor-joining，NJ 法）中的Kimura-2-parameter模型，構建系統發育樹。進化樹的可靠性用Bootstrap分析進行檢測，進行1000個重復。

4 調查結果

4.1 野生動物腸道寄生蟲感染率 75 份糞便樣品經飽和食鹽水漂浮法、沉淀法和分子生物學方法檢測，結果有36份糞便樣品的寄生蟲檢測呈陽性，總感染率為48.0%。感染的寄生蟲有線蟲、絳蟲、芽囊原蟲、吸蟲、螨蟲、球蟲、滴蟲。其中陽性率最高的是線蟲30.7%（23/75），其次是絳蟲13.3%（10/75）、芽囊原蟲12.0%（9/75）、吸蟲8.0%（6/75）、螨蟲4.0%（3/75）、球蟲1.3%（1/75）、滴蟲1.3%（1/75）。單純感染占總感染數的44.4%（16/36）。12 種野生動物中除了豪豬、豬獾外其余10種動物都不同程度地感染了寄生蟲，水鹿、毛冠鹿、豹貓感染較為嚴重。各種動物腸道寄生蟲感染率和寄生蟲種類見表3。

表3 臥龍自然保護區野生動物寄生蟲感染情況

4.2 糞便中芽囊原蟲SSU rRNA 基因的PCR擴增結果 75 份野生動物糞便樣品中，擴增出9份約為600 bp 的陽性樣品，測序結果顯示這9 份樣品均是芽囊原蟲陽性樣品，總感染率為12.0%（9/75），陽性樣品分別來源于3 份水鹿、3 份中華斑羚、1份毛冠鹿、1份中華鬣羚和1份林麝，表明這些野生動物都感染了芽囊原蟲。

4.3 芽囊原蟲SSU rRNA 的序列分析及亞型分布 測序成功的序列在Blast上進行相似性比對，結果顯示有9 個芽囊原蟲陽性樣品，9 個陽性樣品被歸為5 個不同的序列，上傳至NCBI 數據庫，獲得的登錄號為MT764942～MT764946。

基于SSU rRNA基因序列構建的進化樹（圖1）顯示，本次獲得的9 個芽囊原蟲陽性分離株處于5個不同的分支，這與上述歸類結果一致。3份水鹿芽囊原蟲樣品中，1 份屬于ST5 亞型，2 份為ST14。其他芽囊原蟲樣品中，中華斑羚3 份陽性樣品分別屬于ST1、ST5、ST13 亞型，毛冠鹿源為ST13亞型，中華鬣羚源為ST14亞型，林麝源是芽囊原蟲屬。

圖1 基于SSU rRNA基因片段的芽囊原蟲亞型NJ系統分析

5 討論

本次調查發現，四川臥龍自然保護區野生動物的腸道寄生蟲感染率為48.0%，感染率低于福建地區的圈養野生動物（60.0%，24/70）［2］，唐山市野生動物園（55.6%，40/72）［7］，貴州某動物園野生動物（52.0%，13/25）［1］，高于之前徐賢東報道的某動物園野生動物（43.2%，216/500）［8］。這可能是由于圈養野生動物比野外野生動物密度大、飼養環境差導致的，也可能是動物園長期使用同一種驅蟲藥使寄生蟲產生了耐藥性所致，不同的地理位置、海拔、氣候也是影響寄生蟲感染率的一個重要因素。寄生蟲病是危害野外野生動物的主要疾病之一，故應定期監測和評估野生動物寄生蟲感染情況，制定相關防控方案。

據筆者所知，本次是我國第一個關于水鹿和毛冠鹿感染芽囊原蟲的報道。這些亞型中，ST1、ST5 為人獸共患亞型，其中ST1 在非人類靈長類中感染最多，ST14為動物特異性亞型。芽囊原蟲是世界范圍內感染人和動物最常見的腸道寄生蟲之一［9］。芽囊原蟲通常通過囊泡污染的水和食物經糞口途徑傳播，這是傳播的主要方式［10］。先前的研究表明，芽囊原蟲與腸應激綜合征（IBS）和炎癥性腸病（IBD）有關［11］。然而，沒有研究能夠證實囊胚是IBS或IBD的唯一病因［12-13］。在本研究中，芽囊原蟲的患病率為12%，與最近對馴鹿（6.7%）、豬（8.8%）、牛（9.5%）、家雞（13.0%）、丹頂鶴（14.0%）的研究結果相似［14-15］，可見芽囊原蟲的感染與否與是否是野生動物不存在顯著的相關性。

6 調查結論

本調查結果顯示，保護區內的野生動物感染腸道寄生蟲較為普遍，其中線蟲和絳蟲感染最常見，這可能是因為該寄生蟲生活史簡單、易反復感染導致的。保護區內野生動物繁多，分布廣泛，全部進行免疫驅蟲較難實現，但可以對野生動物進行定期的寄生蟲抽查，將感染率控制在安全紅線以下，特別是人畜共患寄生蟲更應該進行密切監測。對于保護區內病死或老死的動物尸體，應妥善處理、查清病因，以免發生疫病傳播。

致謝：感謝四川農業大學動物醫學院實驗室給予的支持和幫助以及陳福浩、樊佳琦、羅靜怡在樣本處理及鏡檢過程中所做出的貢獻！