白菜型冬油菜NCED3基因、啟動子的克隆及其表達分析

武軍艷，馬 驪，方 彥，張亞宏，馬學才，劉麗君，牛早霞，李學才，李愛國，孫萬倉

(1. 甘肅農業大學農學院/甘肅省油菜工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070;2. 甘肅天水市農業科學研究所，甘肅 天水 741001；3. 河北省農作物抗旱研究實驗室，河北 衡水 053000)

白菜型冬油菜是一種新選育的強冬性油菜，可在極端低溫為-20℃～-32℃的地區種植[1-2]，它的成功選育使得我國北方地區農田冬季具有了覆蓋作物，為北方耕作制度改革帶來益處。在我國北方，冬油菜于8月中旬—9月上旬播種，次年3月中、下旬返青，5月下旬開始收獲，收獲后可復種其他作物(玉米、馬鈴薯、向日葵、蕎麥、蔬菜等)，具有顯著的經濟效益。其次，種植冬油菜可充分利用北方的光熱資源，將北方傳統的一年一熟模式轉變為兩年三熟模式[3]，增加冬季土地覆蓋，避免春耕，減少農田土壤表面灰塵[4]，而農田表面灰塵是沙塵暴沙塵的重要來源。

脫落酸(Abscisic acid，ABA)與植物的多種抗逆性有關[5]。在高等植物中，ABA生物合成主要通過間接途徑進行，在此合成途徑中有多種酶參與[5]，其中9-cis環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)基因是關鍵的限速基因[6-7]。因此，在許多植物中NCED均被克隆[8-11]。擬南芥基因組中編碼NCED的同源基因有9個，其中AtNCED3基因的表達可由干旱脅迫誘導[12]；AtNCED3過表達可提高轉基因植物對脫水脅迫的耐受性，這表明AtNCED3的誘導調節了ABA在脫水過程中的積累[13]。干旱脅迫后，煙草的NCED3基因表達上調，ABA含量增加[14]。關于NCED基因在不同脅迫條件下的表達調控及其作用的研究也有很多報道[15-16]。

研究發現，越冬前隨著溫度逐漸降低，白菜型冬油菜的葉片逐漸變黃，ABA含量增加[17]，至越冬期葉片完全干枯，次年返青后自生長點重新長出心葉而完成生殖生長(圖1)。因此，本研究克隆了白菜型冬油菜的NCED3基因及啟動子序列，比較其與甘藍型油菜的差異，并分析了不同脅迫處理條件下NCED3的表達特性，為了解NCED3基因的表達調控和NCED3啟動子的結構特征，培育新的抗逆油菜品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用2個抗寒性不同的白菜型冬油菜品種。隴油6號為超強抗寒性品種，可在我國北方極端低溫為-20℃～-32℃的地區安全越冬，2010―2017年多點平均越冬率為90%；天油2號為強抗寒性品種，可在甘肅天水等地極端低溫為-20℃的地區種植，2010―2017年多點平均越冬率為60%[1,3]。

選取飽滿的上述油菜種子發芽，發芽后將材料播種于10 cm×10 cm的營養缽中，至幼苗生長至5片葉，置于低溫培養箱中，4℃培養10 h后，采集葉片用于RNA的提取。

1.2 基因及啟動子克隆

參照馬驪等[18]方法提取RNA并合成 cDNA 第一鏈。根據GenBank 中公布的在甘藍型油菜A3染色體上的NCED3 (登陸號：LOC103870025)基因的序列，在白菜型油菜基因組中尋找匹配序列，用匹配序列作模板，利用Primer 5.0軟件設計引物(引物序列：ATGACTTCTTTCACGGCGACT，TTACACCTGATTCGCCAAGT)克隆基因。

1.3 序列分析

利用 NCBI 網站的軟件BLAST 和 ORF finder進行核苷酸序列比較和開放閱讀框分析。用Expasy Protparam 軟件分析蛋白質的分子量、等電點和氨基酸組成及疏水性。用Conserved Domains分析蛋白質的結構功能域。蛋白質的二級結構使用在線工具 SOPMA 進行預測，三級結構使用在線軟件Swiss-model 進行模擬。利用BLAST軟件從NCBI的GenBank庫中挑選十字花科植物的NCED3基因編碼蛋白質的氨基酸序列，用DNAMAN8軟件進行氨基酸序列多重比較，用MEGA軟件分析基因同源性并構建系統進化樹。啟動子預測采用Plant CARE 及PLACE在線軟件分析。

1.4 基因表達分析

當幼苗長至5片葉開始進行脅迫處理，分別為低溫脅迫處理：將幼苗置于低溫培養箱中于4℃培養；干旱脅迫處理：葉面噴施20% PEG-6000模擬干旱；ABA處理：葉面噴施100 μM ABA。于各處理后0(對照，CK)、2、4、8、12 h分別取幼苗相同部位的葉片及根系，液氮凍存后提取RNA用于基因表達分析。根據上述1.2節所得基因序列設計引物BN9DN，以油菜“看家基因”Actin作為內參，引物序列見表1。經普通PCR擴增后電泳檢測其特異性，以濃度一致的隴油6號和天油2號葉片cDNA為模板，進行熒光定量PCR，目的基因與內參基因對應各3次重復，采用2-ΔΔCt方法計算[18]。

1.5 數據分析

采用Excel和SPSS進行數據的統計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 NCED3序列分析

隴油6號NCED3的cDNA序列含有一個長度為1 794 bp的完整ORF，編碼含597個氨基酸的蛋白質，屬RPE65超家族，由20種氨基酸組成，其中以Leu、Ala所占比例最高，分別為8.0%、8.2%，相對分子質量約65.74 kD，理論等電點為5.81，總平均親水指數為-0.293，表明該蛋白為親水性蛋白；含有其蛋白家族保守結構域；具有1處最大疏水峰。蛋白質二級結構中含有 27.81% 的α螺旋、23.12% 的延伸鏈、9.72%的β折疊， 39.36%的無規則卷曲，α螺旋和無規則卷曲是NCED3二級結構的主要成分(圖2)。

天油2號NCED3的cDNA序列含有一個長度為1,794 bp的完整ORF，編碼含597個氨基酸的蛋白質，由20種氨基酸組成，其中以Leu、Ala所占比例最高，均為8.0%，相對分子質量約65.78 kD，理論等電點為5.94，總平均親水指數為-0.318，表明該蛋白為親水性蛋白；含有其蛋白家族保守結構域；具有1處最大疏水峰。蛋白質二級結構中含有25.46%的α螺旋、23.62%的延伸鏈、10.55%的β折疊，40.37%的無規則卷曲，無規則卷曲是NCED3二級結構的主要成分(圖3)。

表1 PCR引物序列

圖1 越冬前冬油菜葉片變黃(A)，返青后心葉重新長出(B)Fig.1 Winter rapeseed leaves turn yellow (A) and then dry before wintering and grow new leaves (B) next year

圖2 隴油6號NCED3的結構域(A)、疏水性(B)及三級結構模型(C)Fig.2 Analysis of protein domain (A), hydrophobicity (B), and tertiary structure model (C) of NCED3 in Longyou 6

2.2 NCED3序列比對及進化發育分析

由圖4可見，L6NCED3與BnNCED3蛋白相比，有5處發生氨基酸變化，相似度為99.16%，與BrNCED3有1處氨基酸不同。T2NCED3與BnNCED3蛋白相比，有6處發生氨基酸變化，相似度為98.99%，與BrNCED3有6處氨基酸不同。L6NCED3 與 T2NCED3有5處發生氨基酸變化，相似度為99.16%。對白菜型冬油菜及其他近緣種的NCED3進行同源性比較及系統進化分析(圖5)，隴油6號與白菜的同源性最高，相似度為99.83%，其次為甘藍型油菜、天油2號。隴油6號與天油2號的相似度為99.16%。其中，隴油6號與白菜的相似度最高，天油2號與甘藍型油菜的相似度最高。從進化關系分析(圖5)，所選的14個種與參試材料可被分為5類。隴油6號、白菜、甘藍型油菜、天油2號及甘藍的NCED3在同一分類中。可見NCED3蛋白比較保守，從而也可推斷NCED3在白菜型冬油菜中的功能與甘藍型油菜相似。

2.3 啟動子序列分析

2個品種的啟動子序列相似性為99.38%。啟動子序列預測結果顯示，啟動子具有ABRE、TGA-element、CGTCA-motif、TGACG-element等激素響應元件(表2)。此外，還鑒定出低溫響應元件(LTR)、防御和應激響應元件(TC-rich repeat)、生物過程中常見的順式作用元件如CAAT-box等、分生組織表達CAT-box相關的順式作用元件及- 30 TATA box附近的核心啟動子元件等?？梢姡琋CED3基因對不同的非生物脅迫有不同的響應。2個品種中只有1個不同的元件(circadian)，該元件與晝夜節律控制有關。

圖3 天油2號NCED3的結構域(A)、疏水性(B)及三級結構模型(C)Fig.3 Analysis of protein domain (A), hydrophobicity (B), and tertiary structure model (C) of NCED3 in Tianyou 2

表2 啟動子DNA順式作用元件預測

2.4 NCED3表達分析

由圖6可見，脅迫處理后NCED3在葉片和根中的表達均高于CK，且均呈上升趨勢，于8 h達到峰值后略有下降，說明ABA、低溫和干旱均可誘導NCED3基因表達。ABA處理后(圖6A)，NCED3在2個品種葉片和根中的表達均上調，其中天油2號的增長幅度高于隴油6號。低溫處理后，基因表達與ABA處理呈現相似的表達趨勢(圖6B)；隴油6號葉片在4 h時的表達水平低于CK，可能是脅迫下的強烈應激反應所致。PEG處理后，基因表達隨處理時間延長呈逐漸增加的趨勢，于8 h顯著增高后降低(圖6 C)。與根系的表達特性相比，3種處理后葉片的基因表達均在2 h顯著升高，天油2號的升高幅度均大于隴油6號，可推斷天油2號的葉片比隴油6號對脅迫的反應更快，脅迫后基因表達快速升高，合成積累大量的ABA來應對脅迫。

注：(A) ABA處理后的NCED3基因表達；(B) 低溫(4℃)處理后NCED3基因表達；(C) PEG處理后NCED3基因表達。小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。Note: (A) NCED3 gene expression under ABA treatment; (B) NCED3 gene expression under low temperature (4℃) treatment; (C) NCED3 gene expression under PEG treatment. Different lowercase letters indicate significant differences (P≤0.05).圖6 不同處理條件下NCED3表達分析Fig.6 The effects on NCED3 expression by different treatments

3 討論與結論

基因結構的改變會導致基因表達的改變，擬南芥中AtNCED3的274和327位氨基酸的變化可能導致其表達的改變[19-20]。在本研究中，隴油6號和白菜的NCED3同源性較高，而天油2號與甘藍型油菜的NCED3同源性較高；2個抗寒性不同的冬油菜NCED3相似度很高，且親緣關系很近?？梢奛CED3蛋白比較保守，從而也可推斷NCED3在白菜型冬油菜中的功能與甘藍型油菜相似。

基因啟動子中所含的順式作用元件在基因表達調控中起著重要作用，基因的不同啟動子特征決定了基因的不同表達特征[21-22]。根據預測結果2個品種的啟動子相似性高，具有常見的與激素有關的元件如：ABRE、TGA-element、CGTCA-motif、TGACG-elemen等，可見NCED3基因的表達可能受到生長素、脫落酸、茉莉酸甲酯等的調控，本研究結果也表明ABA處理可誘導NCED3基因的表達。光可以參與植物的光合作用，也是一種非常重要的信號物質，從而調節基因轉錄[23-24]。本研究的啟動子有3個與光相關的元件：G-box、TCT-motif和chs-CMA2a，它們通常存在于光誘導基因的啟動子中；由此推斷，NCED3的表達可能會受到光照的調控。在本研究結果中，白菜型冬油菜啟動子中有1個特殊的元件，即低溫響應元件(low-temperature responsiveness, LTR)，該元件在其他被報道植物的NCED啟動子中不存在[25-28]。因此推測，該基因可能受低溫調控,本研究的基因表達分析結果也證實了該推測。本試驗首次分析了低溫(4℃)處理對NCED3表達的影響，低溫可誘導白菜型冬油菜NCED3的表達。2個品種中有1個不同的DNA元件，即晝夜節律控制元件，它與季節反應的調節、從營養生長到生殖生長的轉變以及休眠的開始等相關[29]。種子萌發、下胚軸伸長、葉片運動、氣孔導度、開花、衰老等發育過程均通過晝夜節律鐘進行調節[30]。根據形態學觀察，天油2號的下胚軸長度確實比隴油6號的長。因此，如果與晝夜節律控制因素有關，這種差異是否與2個品種的抗寒性有關，可以作為我們今后研究的方向。

本研究中，NCED3基因可以在冬油菜的根和葉中表達，而沒有組織特異性，這與擬南芥的研究結果相似[31]。經過低溫、PEG模擬干旱和ABA處理后，NCED3在隴油6號和天油2號中的表達量均增加。已有研究表明，NCED3通過調控ABA的合成，在植物耐旱性方面發揮重要作用[32]。本研究中干旱脅迫可誘導NCED3的表達，12 h前表達量急劇增加，12 h后下降，這與Xian等[32]和Zhang等[11]的研究結果基本一致。本研究中，在低溫、模擬干旱及噴施ABA處理中，隨著處理時間延長，天油2號的NCED3基因表達增加幅度均高于隴油6號(包括葉片和根)，由此可見，逆境脅迫后弱抗寒品種比強抗寒品種更敏感，脅迫初期快速做出反應，調控基因表達來應對逆境，該結論與Zeng等[33]的結果相似。