作物青枯病研究進展

佘小漫，何自福

（廣東省農業科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640）

茄科雷爾氏菌〔Ralstonia solanacearum（Smith）Yabuuchi〕，也稱為茄科勞爾氏菌、茄科茄科青枯菌（簡稱青枯菌），屬薄壁菌門β-變形菌綱雷爾氏菌屬（Ralstonia），為革蘭氏陰性、好氧棒狀桿菌。該病原菌由Smith（1896）最先鑒定，并定名為茄青枯假單胞菌（Pseudomonas solanacearum,E.F.Smith, www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy）。1992年，Yabuuchi等［1］根 據 DNA-DNA、DNA-RNA分子雜交，以同源性分析為基礎將其歸入伯赫氏屬，命名為青枯伯克霍爾德菌（Burkholderia solanacearum）；隨后通過對16S rRNA基因組序列測定和聚類分析，Yabuuchi等又建議成立一個新屬——雷爾氏屬（Ralstonia），將青枯伯克霍爾德菌、皮克特伯克霍爾德菌（Burkholderia pickettii）和Alcaligenes euterophus列入此屬［2］。

該病原菌侵染引起的植物細菌性青枯病是熱帶、亞熱帶和溫帶地區最重要、最具破壞性的植物細菌病害之一，被認為是一種毀滅性植物病害。青枯菌可通過土壤和灌溉水進行傳播，遇到寄主植物后從根部侵入，進入木質部維管束，通過維管束系統迅速擴散到植物地上部組織。由青枯菌侵染引起的病害典型癥狀表現為木質部變褐，葉片偏向性生長以及植株萎蔫［3］。

青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染50多科200多種植物［4］，主要包括番茄等茄科植物、花生等豆科植物、菊花等菊科植物以及桑樹、桉樹等木本植物。在我國，已報道有番茄、茄子、馬鈴薯、煙草、花生、南瓜、生姜、沙姜、桑、空心菜、桉樹、木麻黃、芝麻、無花果、廣藿香、紅掌、萬壽菊、甘薯等90余種作物受到茄科雷爾氏菌為害［5］。除了西藏自治區和澳門沒有相關報道外，我國已經有30個省份有青枯病報道［5］，而廣東、廣西、福建、湖南、四川是青枯病多發、重發省份。青枯病造成的產量損失一般會超過50%，甚至絕收，是許多作物生產的重要限制因子［6］。

1 茄科雷爾氏菌多樣性及基因組特征

1.1 茄科雷爾氏菌的多樣性

青枯菌存在明顯的生理分化。不同地理起源的青枯菌在與其寄主長期協同進化的過程中，演化出明顯的生理分化或菌系多樣性［7］。根據青枯菌的寄主范圍差異，將其劃分為5個生理小種（race）［8-10］；基于對 3種雙糖和 3種己醇的氧化利用情況，可將其劃分為5個生化變種（biovar）［10-13］。Cook等利用 RFLP技術將青枯菌劃分為亞洲分支和美洲分支［14-15］。隨后，研究者通過對青枯菌HRP簇基因指紋圖譜分析、16S rRNA 基因分析［16-19］、16S-23S rDNA間隔區和內切葡聚糖酶和hrpB基因分析［17,20］，又發現了2個青枯菌分支，即非洲分支（包含來自非洲的菌株）和印尼分支（包含來自印度尼西亞的菌株）；此外，還發現了青枯菌的2個近緣種，為害丁香樹的蒲桃青枯菌Ralstonia syzygii和引起香蕉血液病的BDB菌［19］。可見，青枯菌的遺傳多樣性十分突出。

2005年，Fegan等［21］提出了青枯菌是一個復合種概念〔R. solanacearumspecies complex（RSSC）〕，并根據16S-23S rDNA基因間隔區序列、內切葡聚糖酶egl基因和hrpB基因的分析，提出了青枯菌種下劃分為演化型的新分類框架。青枯菌演化型的分類框架包括4個不同水平的分類單元：種（Species）、演化型（Phylotype）、序列變種（Sequevar）和株系（Clone），并且建立了相應的鑒定方法［21］。利用演化型特異性復合PCR青枯菌可分為4個演化型，演化型Ⅰ和Ⅱ分別對應亞洲分支和美洲分支，演化型Ⅲ包含來自非洲的菌株，演化型Ⅳ包含來自印度尼西亞菌株以及青枯菌近緣種R. syzygii和BDB菌。根據菌株egl基因序列同源性，每個演化型的菌株又分為多個不同的序列變種。目前，已經鑒定出57個序列變種［22］。可見，這種種下分類方案較好地反映出青枯菌的遺傳進化與地理起源。

2011年，Remenant等［23］通過基因組分析建議將青枯菌分為3個種。2014年，Safni等［24］通過DNA-DNA雜交分析，修正了Remenant等的建議，將青枯菌分為4個種，并建議演化型Ⅰ和演化型Ⅲ的菌株為一個種，命名為Ralstonia pseudosolanacearumsp. nov.，演化型Ⅱ菌株為一個種，沿用原來R. solanacearum的種名，演化型Ⅳ菌株歸入R. syzygii中。2016年，Prior等［25］結合青枯菌表型分析，基因組比對和轉錄組分析，支持了Remenant等的建議，將青枯菌分為3個種，演化型Ⅰ和演化型Ⅲ的青枯菌株為一個種，演化型Ⅱ的青枯菌株為一個種，演化型Ⅳ青枯菌株、R.syzygii和BDB菌為一個種。2020年，Etminani等［26］利用青枯菌57個看家基因系統發育分析進一步支持該命名觀點。

1.2 茄科雷爾氏菌基因組特征

2002年，Salanoubat等完成了第一個來自番茄的青枯菌基因組測序分析［27］。青枯菌基因組包含兩個復制子，即染色體和宏質粒，這兩個復制子的G+C含量幾乎相同。全基因組平均大小約為5.8 Mb，其中宏質粒約占全基因組的1/3［27-28］。染色體和宏質粒上均含有與致病性相關的重要基因，大部分的看家基因功能由染色體決定，而宏質粒只具有部分重要基因，富含致病島基因和菌株特異基因［20,27-28］。青枯菌的環境適生性和致病性功能大部分由宏質粒決定，包括III型分泌系統和VI型分泌系統、鞭毛運動性相關基因、趨藥性基因和胞外多糖合成基因簇均在宏質粒上［29］。青枯菌基因組除了這兩個復制子之外，目前發現了青枯菌基因組還存在小質粒，如青枯菌株CMR15和Psi07分別含有35 kb和13 kb的小質粒［28］，HA4-1菌株含有2個大小分別為1 947 245 bp和143 755 bp的質粒［30］。

青枯菌是一個高異質性的細菌，一個菌株的基因組序列不能代表整個青枯菌物種。截至2020年 9月 30日，NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#!/prokaryotes/490/）上顯示，全球已有203株青枯菌被測序，其中94株青枯菌為全基因組，13株菌株僅完成染色體測序，另外有96株青枯菌的基因組組成為多個scaffold或contig狀態。而完整測序的94株青枯菌菌株主要分離自番茄（41株）、馬鈴薯（28株）、煙草（5株）、香蕉（3株）、大焦（2株）、茄子（2株）、沙姜（2株）、花生（1株）、黃瓜（1株）、芝麻（1株）、龍葵（1株）、木麻黃（1株）和芝麻（1株），另外分離自土壤的菌株1株，未知來源的菌株4株。隨著測序技術的快速發展和測序成本的逐步降低，越來越多的分離自不同寄主的青枯菌菌株全基因組被測序，這些結果將有利于揭示青枯菌的致病性和寄主特異性。

2 茄科青枯病在廣東的發生與為害

廣東橫跨熱帶、亞熱帶地區，常年高溫、多雨，植物終年生長繁殖，這些為青枯病的發生流行創造了十分有利的條件，每年由青枯菌侵染引起的作物青枯病在廣東發生與危害均十分嚴重。廣東是國內最早記錄有青枯病發生的省份［6］。本團隊長期調查與監測表明，在廣東，青枯菌侵染引起了多種作物青枯病，除前人報道的番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯、花生、煙草、姜、桑、桉樹、甘薯、美人蕉、沙姜等寄主植物外，空心菜、菊花、向日葵、廣藿香、勝紅薊、南瓜和人參果等作物上也發生了由茄科雷爾氏菌侵染引起的青枯病。截至目前，在廣東至少有35種植物發生了茄科雷爾氏菌侵染引起的青枯病。

不同作物的青枯病為害情況不同。多年調查表明，南瓜青枯病病株率5%～12%，勝紅薊青枯病病株率3%～5%，廣藿香青枯病病株率12%～21%，沙姜青枯病病株率7%～60%，生姜青枯病病株率8%～35%，番茄青枯病病株率45%～80%，茄子青枯病病株率5%～25%，辣椒青枯病病株率13%～30%，馬鈴薯青枯病病株率10%～25%，花生青枯病病株率7%～13%，煙草青枯病病株率10%～35%，甘薯青枯病病株率3%，空心菜青枯病病株率7%，菊花青枯病病株率10%，人參果青枯病病株率17%［31］，向日葵青枯病病株率23%和仙草青枯病病株率14%。

作物青枯病在廣東的分布存在差異。番茄、茄子和辣椒青枯病在廣東省的分布范圍最廣，番茄青枯病主要分布在11市21縣（市、區、東莞市麻涌鎮）、茄子青枯病主要分布在9市13縣（市、區、東莞市2鎮）、辣椒青枯病主要分布在7市9縣（市、區、東莞市麻涌鎮）；花生青枯病在陽江市陽春、廣州市、梅州市興寧和河源市等地有分布；空心菜青枯病在廣州市、肇慶市、惠州市和中山市有分布；大肉姜青枯病在陽江市、惠州市和肇慶市有分布；馬鈴薯青枯病在惠州市、廣州市及茂名市有分布；而廣藿香、沙姜、南瓜、甘薯、煙草、勝紅薊、人參果、向日葵、仙草、菊花、桉樹和桑樹等作物青枯病只在廣東特定區域發生（表1）。

3 茄科青枯菌廣東種群特征分析

3.1 不同寄主來源青枯菌代表菌株生理小種鑒定

1999—2020年，本團隊在廣東各地共采集不同作物青枯病疑似病樣1 545份，對疑似病樣進行分離與鑒定，共保存19種寄主植物的青枯菌1 045株，包括番茄（267株）、茄子（113株）、辣椒（117株）、馬鈴薯（87株）、花生（59株）、南瓜（53株）、大肉姜（56株）、沙姜（48株）、空心菜（46株）、甘薯（18株）、煙草（32株）、勝紅薊（32株）、人參果（21株）、向日葵（30株）、仙草（18株）、廣藿香（18株）、菊花（13株）、桉樹（12株）和桑（5株）。

通過室內人工接種方法，利用鑒別寄主番茄、茄子、煙草、香蕉、姜、馬鈴薯及菌株的來源寄主植物對16種寄主來源的青枯菌代表菌株致病力進行測定，結果表明：分離自南瓜、番茄、茄子、辣椒、煙草、花生、空心菜、菊花、廣藿香、桉樹、甘薯等11個寄主的青枯菌菌株可侵染大多數的茄科作物，屬于1號生理小種［22,32-33］；分離自馬鈴薯的青枯菌菌株主要侵染馬鈴薯，弱侵染番茄和煙草，屬于3號生理小種；分離自姜、沙姜和勝紅薊的青枯菌菌株主要侵染姜，弱侵染馬鈴薯，番茄等其他作物，屬于4號生理小種［34-35］；分離自桑樹的青枯菌菌株對桑的致病力很強，但對番茄、馬鈴薯、茄子和辣椒的致病力很弱，屬于5號生理小種。

表 1 廣東省作物青枯病發生與分布Table 1 Occurrence and distribution of crop bacterial wilt in Guangdong Province

3.2 不同寄主植物來源的青枯菌生化特性分析

測定了分離自16種寄主作物110個青枯菌菌株的生化變種，結果表明， 110個菌株中，1個菌株不能利用麥芽糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、甘露醇和衛矛醇這六種碳水化合物，屬于生化變種1；2個分離自馬鈴薯菌株可以利用麥芽糖、乳糖和纖維二糖，不能利用山梨醇、甘露醇和衛矛醇，屬于生化變種2；55個菌株可以利用麥芽糖、乳糖、纖維二糖、山梨醇、甘露醇和衛矛醇6種碳水化合物，屬于生化變種3（占50%）；52個菌株可以利用山梨醇、甘露醇和衛矛醇，不能利用麥芽糖、乳糖和纖維二糖，屬于生化變種4（47.3%）。生化變種3和生化變種4是廣東省青枯菌優勢生化變種［36］。

3.3 廣東青枯菌種群遺傳多樣性分析

110個代表菌株中，108個菌株屬于演化型I，2個分離自馬鈴薯的菌株屬于演化型II。110個菌株分屬11個序列變種，分別為序列變種1、13、14、15、17、18、34、44、45、48 和 57，其中序列變種45是我國的首次報道，序列變種57是首次發現。序列變種15、34和44是廣東省分布最廣的序列變種，在廣東各地均有發現；序列變種 13、14、17、45 和48只在我省粵西和中部地區發現；序列變種1和18只在我省中部地區出現；序列變種57在我省粵西地區發現；粵東和粵北地區目前只發現序列變種15、34和44。同一寄主的菌株存在多種序列變種，從番茄上分離到的青枯菌存在8個序列變種，從馬鈴薯上分離到的青枯菌存在6個序列變種，從沙姜上分離到的青枯菌存在5個序列變種，從茄子和辣椒上分離到的青枯菌存在4個序列變種，從南瓜和花生上分離到的青枯菌存在3個序列變種，從生姜、煙草、空心菜和廣藿香上分離到的青枯菌各存在2個序列變種，而從菊花、甘薯、勝紅薊、桉樹和桑上分離的青枯菌只存在1種序列變種［22,36］。這些研究結果將有助于我省作物青枯病防控策略的制定。

3.4 廣東青枯菌種群致病性分化

通過接種鑒別寄主植物，對來自廣東各地番茄、茄子和辣椒上的青枯菌的致病力分析，明確了廣東青枯菌致病力存在明顯的分化現象。根據10個鑒別寄主植物的病株率，31個青枯菌代表菌株聚類為3個組（或致病型），其中第Ⅰ組菌株主要來自種植番茄和茄子歷史較長的廣州、東莞菜區，其致病力較強；第Ⅱ組菌株主要分離自茄子和辣椒上，其致病力中等；第Ⅲ組菌株主要來自番茄種植時間較短的區域，其致病力也較弱。寄主植物和栽培耕作制度可能是影響青枯菌致病力分化的主要因子［37］。此外，選取10個分離自不同寄主、不同序列變種的23株青枯菌代表菌株對感病和抗病番茄品種的致病性測定，根據病株率對23株青枯菌菌株進行了系統聚類分析，結果表明：23株青枯菌菌株分為2個分支，分離自馬鈴薯上的屬于青枯菌演化型II、序列變種1的RS413菌株對抗病番茄品種LS-89不致病，對感病番茄品種東茄致病力極弱，自成一分支；其余22株分離自番茄、茄子、煙草、辣椒、馬鈴薯和南瓜的演化型I的青枯菌菌株對LS-89和東茄兩個番茄品種存在不同程度的致病力，聚類成一分支［24］。

3.5 廣東青枯菌各分離物基因組特征

3.5.1 青枯菌廣東番茄分離物RS163菌株基因組特征 分離自番茄的青枯菌存在多個致病型或序列變種。本團隊完成來自番茄的4個不同序列變種的菌株測序，其中菌株RS163基因組與其他3個菌株基因組差異較大。RS163菌株基因組大小為6 298 980 bp，存在環狀的染色體、宏質粒和小質粒，大小分別為3 980 373、2 095 415、223 192 bp，GC含量分別為66.69%、66.85%和61.44%。與其他青枯菌基因組相比，RS163菌株基因組遠大于青枯菌基因組平均大小（5.8 M）。毒性因子基因和III型分泌系統核心基因與其他青枯菌是否存在差異正在分析中。

3.5.2 青枯菌廣東沙姜分離物YC45菌株基因組特征 分離自沙姜的青枯菌屬4號生理小種，本團隊率先完成了沙姜分離物YC45菌株的全基因組測序。YC45菌株基因組大小為5 732 909 bp，包含了1個染色體和1個宏質粒，大小分別為3 724 487、2 008 422 bp，GC含量分別為67.193%和66.896%［38］，與其他演化型青枯菌基因組相比，YC45菌株基因組結構存在大量差異區域；毒性因子基因和Ⅲ型分泌系統核心基因存在較大差異。這些結果為進一步解析青枯菌多樣性、進化、致病機理及寄主特異性等研究奠定了基礎。

4 作物青枯病防控技術研究

4.1 作物品種對青枯病抗性水平的鑒定與評價

鑒定與評價廣東生產上推廣種植的品種抗病性水平。在對廣東青枯菌種群致病性分化研究基礎上，通過室內人工苗期接種鑒定方法，評價了廣東生產上推廣種植的番茄、茄子、花生和南瓜主要品種對青枯病的抗性水平，篩選出年豐、穗豐和益豐3個番茄品種對番茄青枯病表現為中抗（耐病）［39］；冠軍紫紅茄、長優紫長茄、華育二號紫紅長茄、宏運茄王、長豐二號和新豐1 號紫紅長茄這6 個品種對茄子青枯病表現為抗病；美豐三號紫長茄、紫龍長豐Ⅲ、福將紫紅長茄、紫榮6 號長茄、中冠二號紫長茄、金卡龍三號紫紅長茄、旭紫長茄、農豐紫紅茄、農夫長茄、圣紫和特級32 號這11 個茄子品種對茄子青枯病表現為中抗（耐病）［40］；汕油188對花生青枯病表現為高抗，仲愷1號、仲愷花2、仲愷花3、仲愷花4、汕油523 、汕油51和汕油199對花生青枯病表現為中抗（耐病）；香芋小南瓜（廣州世茂農業科技有限公司）和香蜜小南瓜（廣東科農蔬菜種業有限公司）對南瓜青枯病表現為中抗（耐病）［22］。

鑒定與評價省蔬菜品種區試新品種抗病性水平。自2002年起，本團隊一直承擔廣東省蔬菜品種區域性試驗抗病性水平鑒定任務。19年來，共鑒定與評價了59個番茄品種、57個茄子品種、81個辣椒品種、119個花生品種和19個馬鈴薯品種的抗病性水平，其中番茄、茄子、辣椒、花生和馬鈴薯抗青枯病品種所占比例分別為8.47%、14.04%、3.7%、1.68%和0，耐病品種比例分別為10.17%、47.37%、34.57%、47.9%和15.79%，而感病品種比例分別為81.36%、38.59%、61.73%、50.42和84.21%。可見，參加廣東省蔬菜品種區試的這5類作物新品種中，除了茄子品種外，其余4種作物的大部分品種不抗病，導致這種現狀的主要原因：一是抗性育種資源缺乏；二是廣東省青枯菌種群結構復雜，不同寄主的青枯菌可侵染多種作物。

4.2 茄科作物抗青枯病育種研究

廣東省農業科學院植物保護研究所與亞洲蔬菜研究發展中心積極合作，開展抗病、優質種質資源的引進與創新利用研究，對收集的835份番茄材料與自交系、309份茄子材料［41］、29份辣椒資源進行了抗病性鑒定，篩選出高抗青枯病番茄材料9份、抗病材料27份，高抗青枯病茄子材料7份、抗病材料33份，高抗青枯病辣椒材料2份、抗病材料20份。配合廣東省農業科學院蔬菜研究所和農業科研試驗示范場以及廣州市農業科學研究院開展番茄、茄子和辣椒等抗青枯病資源篩選與新品種選育，先后創制出抗病番茄品種益豐、益豐2號、阿克斯一號、粵科達301［42］等，抗病茄子品種紫榮4號、紫榮6號、玫瑰紫花茄、豐寶紫紅茄、翡翠綠2號［43］等，以及抗病辣椒品種辣優2號、辣優6號、辣優9號、辣優15號、辣優13號［44］等新品種。這些新品種在廣東、廣西及海南等華南地區得到推廣應用，為控制青枯病的流行和保障作物安全生產發揮了重要作用。

4.3 作物青枯病防控技術的集成與示范

我們根據廣東省茄科青枯菌的特性及青枯病的發生流行動態，因地制宜地開展了茄科青枯病防控技術集成示范。提出了“防病栽培為基礎，抗病品種利用為中心，藥劑防控為輔”的作物青枯病防控策略，技術措施包括：選擇種植抗病優質的品種或嫁接苗，不同類型的抗病品種輪植，用無病新土培育健康壯苗，大田增施有機肥或使用微生物菌肥為基肥和施入適量的石灰以改良土壤，及時清除病株，在移栽前以及移栽后灌根多粘類芽孢桿菌、蠟質芽孢桿菌等藥劑。

在過去的十多年中，本團隊先后在在廣州市增城區、南沙區開展了番茄青枯病控制技術集成示范；在清遠市連州、佛山市高明區、惠州市惠東縣和茂名市高州開展了茄子青枯病控制技術集成示范；在茂名市高州、佛山市高明區、湛江市遂溪縣和徐聞縣、惠州市惠東縣、廣州市花都區進行辣椒青枯病控制技術集成示范；在廣州市增城區進行馬鈴薯青枯病控制技術集成示范；在廣東省沙姜主產區陽江市陽春進行沙姜瘟控制技術集成示范等。這些技術集成示范均取得了較好成效，為茄科青枯病的防控技術推廣應用積累了經驗。

5 問題與展望

茄科雷爾氏菌是一個復合種，其種群內多樣性十分突出。這種多樣性表現在生理生化特性、基因組組成與基因序列、對寄主植物致病性與致病力等方面顯著差異，甚至包括致病機制不同。這種多樣性不僅出現在不同寄主來源的菌株間，而且也出現在同一寄主來源的菌株/分離物間，這對其監測與防控尤其是抗病育種等帶來了挑戰。

作物青枯病是典型的土傳病害，其病原青枯菌在無寄主植物時可在土壤、水體中存活長達5年以上，防控難度極大。種植抗病品種是控制該病害最有效、經濟的方法，也是目前生產上應用的主要防治措施。但青枯菌種群存在豐富的多樣性，長期、大面積種植某一類抗病品種，極易導致抗病品種的抗性容易喪失。為了延長抗病品種的使用年限，在監測特定區域青枯菌種群動態及致病力分化前提下，要做好作物品種抗性/抗病基因的多源化及不同抗病品種的合理布局。

藥劑防控青枯病也是生產上常用的措施，目前在我國登記用于防控作物青枯病的藥劑34個，有效成份主要是熒光假單胞桿菌、多粘類芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟質芽孢桿菌、海洋芽孢桿菌、中生菌素、三氯異氰尿酸、噻菌銅、噻森銅、噻唑鋅等，這些登記藥劑以防治番茄（20個）、煙草青枯病（14個）為主，其他作物如辣椒、茄子、姜等上僅登記1～2個藥劑，多數作物青枯病目前還沒有登記藥劑，而且這些藥劑在田間實際防控效果有限，遠不能滿足生產需要。因此，對青枯病有效的藥劑尤其是免疫誘抗劑和生防菌研發將是未來重點研究方向。

人類對青枯菌的研究已有一百多年歷史，人類與青枯菌的斗爭仍將是一個長期的課題。由于青枯菌種群結構復雜，寄主范圍廣，目前對青枯菌寄主特異性機理研究較少，尤其是關于演化型I青枯菌寄主特異性機理研究尚未見報道。這提示我們應重視青枯菌侵染不同寄主機理的研究。隨著更多不同寄主菌株的全基因序列測定，通過生物信息學比較分析與高通量基因功能驗證技術，將有助于我們解析青枯菌寄主特異性機理。

近年來，作物青枯病的發生與危害有加重的趨勢，青枯菌新寄主植物也不時出現。隨著我國現代農業的快速發展，作物生產的規模化、集約化、機械化正在擴大，并將成為主要生產方式，青枯病的發生與危害風險會逐步加大。因此，要加強對茄科雷爾菌種群動態長期、系統監測，同時開展高效、持久的防控技術研發，實現對青枯病的有效控制。