五倍子分離組分抑制無乳鏈球菌的熱動力學(xué)研究

鄭夢珍，佟延南，翟少偉，林 茂，江興龍，賴曉健，李忠琴

( 1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021； 2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市漁用藥物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021； 4.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 海口 570206 )

在各類病害中，細(xì)菌性疾病仍是主要的問題，其中無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)不僅感染多種養(yǎng)殖魚類，如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、斑馬魚(Brachydaniorerio)等[1-2]，而且還能感染人類和哺乳動物[3-4]，造成極大的經(jīng)濟損失。抗生素等化學(xué)藥物雖是細(xì)菌性疾病的主要防治手段，但長期使用會出現(xiàn)致病菌耐藥性增強、藥物殘留、環(huán)境污染等問題，這使得人們不斷尋求更加安全綠色的防治手段。我國中草藥儲備非常豐富，其中許多種類具有毒副作用小、抗病毒、抑菌、純天然等優(yōu)點，在治療疾病中有顯著的療效，擁有廣闊的開發(fā)前景[5]。

五倍子(GallaChinensis)是癭綿蚜科，蚜蟲刺傷漆樹科，漆樹屬鹽膚木的葉或葉柄而形成的囊狀蟲癭。五倍子主要有效組分為鞣質(zhì)、沒食子酸等。其中鞣質(zhì)是五倍子的主要組分，含量可達(dá)70%[6]。研究表明，五倍子具有抗菌、抗寄生蟲、抗氧化、止瀉等生物活性[7-10]。五倍子是水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于防治細(xì)菌性疾病的重要藥材。Wu等[11-12]研究表明，五倍子對副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的生長均有明顯抑制作用。中草藥的成分復(fù)雜，在漁業(yè)病害防治工作中很難做到高效利用，因此，在開發(fā)新型高效的漁用藥物過程中，對中藥的活性物質(zhì)進行分離和藥效分析必不可少。

本試驗采用高速逆流色譜法，從五倍子粗提物中分析及分離出五倍子活性組分[13]，分離五倍子的溶劑體系通過檢測器時，其不同極性的組分會產(chǎn)生不同大小的信號，進而分離制備。筆者采用根據(jù)生物熱動力學(xué)參數(shù)和熱譜圖比較分析藥物藥效作用的微量熱法[14]，測定五倍子粗提物和各分離組分對無乳鏈球菌的體外抑制效果，表現(xiàn)為隨時間變化所放出的全部熱量，根據(jù)五倍子各組分對無乳鏈球菌的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，篩選出具有較好抑制作用的五倍子組分，在制藥過程中去除五倍子無效組分，提高藥效，降低用藥量，為漁用中藥制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

五倍子，購于福建銘遠(yuǎn)制藥有限公司。

無乳鏈球菌(TN3L)為本實驗室分離鑒定保藏菌株。

1.2 儀器與試劑

無水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)、乙酸乙酯(西隴科學(xué)股份有限公司)、二甲基亞砜(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)、腦—心浸出液肉湯(廣東環(huán)凱微生物科技公司)、瓊脂粉(廣東環(huán)凱微生物科技公司)。

大容量高速冷凍離心機(北京昊諾斯科技有限公司，RC-6 Plus型)、超聲波粉碎儀(南京先歐儀器制造有限公司，X0DL-1000N)、多樣品平行蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-215)、分析型高速逆流色譜(上海同田生化技術(shù)有限公司，TBE-20A)、制備型高速逆流色譜(上海同田生化技術(shù)有限公司，TBE-300B)、離心濃縮儀(Labconco CentriVap，美國)、滅菌鍋(AUTOCLAVE，美國，G154DS型)、酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，美國，1510-00669C)、生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司， LRH-250)、微量熱儀(Waters LC，美國，TAMⅢ)。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備五倍子粗提物

精確稱取五倍子藥粉(粒徑約150 μm)，以料液比1∶5與70%乙醇進行混合，浸泡30 min后，在超聲破碎儀下提取30 min，重復(fù)提取2次后，于大容量高速冷凍離心機中3000 r/min離心20 min，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70 ℃條件下蒸發(fā)獲得浸膏。將所得浸膏烘干后研磨，得到五倍子醇提物藥粉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高速逆流色譜儀分析和分離提取五倍子粗提物各組分

通過五倍子組分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和溶劑極性大小確定溶劑最佳分離體系為：乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)，可分離5個峰[15]。使用分析型高速逆流色譜儀(HSCCC)(TBE-20A)測試并驗證試驗條件，記錄并根據(jù)公式計算固定相保留率：

固定相保留率/%=(V1-V2)/V1×100%

式中，V1為色譜柱線圈體積，V2為固定相被推出的體積。

利用分析型高速逆流色譜的試驗條件，將已確定的溶劑體系在制備型高速逆流色譜上進行放大，分離提取出五倍子的不同組分。將收集分離提取物蒸發(fā)干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 微量量熱法測定五倍子對無乳鏈球菌TN3L的生物活性

使用TAMⅢ六通道微量熱儀測定五倍子各組分及其粗提物對無乳鏈球菌的體外抑制作用。精確稱取制備的五倍子醇提物及分離的5個組分藥粉，選用1 mL 5% 二甲基亞砜作為溶劑對其進行溶解。將6管已經(jīng)過高壓滅菌的安瓿瓶進行編號，在無菌條件下，向各安瓿瓶中分別加入液體培養(yǎng)基2.25 mL，并接種107cfu/mL的菌液100 μL；在編號為2～5的安瓿瓶中加入不同體積的藥液以制成具有濃度梯度的處理組，編號1和編號6安瓿瓶分別設(shè)置為空白對照組和溶劑對照組，結(jié)束操作后密封。提前設(shè)置儀器工作溫度為28 ℃，后按編號將安瓿瓶分別放入微量量熱儀的6個通道中，記錄試驗，得到關(guān)于細(xì)菌生長代謝的熱功率隨時間變化的關(guān)系(P-t)曲線。

1.3.4 細(xì)菌生長代謝受藥物作用影響下的熱動力學(xué)研究

微生物的指數(shù)生長期中產(chǎn)熱功率(Pt)與速率常數(shù)(k)之間存在如下關(guān)系式[16]：

Pt=P0exp(kt)或lnPt=lnP0+kt

式中，P0為細(xì)菌指數(shù)生長期起始點的熱功率，t為指數(shù)生長期中某一對應(yīng)的t時刻。

在熱譜曲線上，取指數(shù)生長期的一段Pt與t的數(shù)值，代入上述公式中，并運用Matlab進行計算，得到k值，再與藥物含量(c)擬合成k與c的曲線方程。

為定量描述各組分對細(xì)菌的抑制效果，通常定義抑制率I如下：

I=(k0-kc)/k0×100%

式中，k0為空白組安瓿瓶中菌株生長速率常數(shù)，kc為藥物含量為c時菌的生長速率常數(shù)。

一定含量下，抑制率值越大，表明抑菌能力越強，當(dāng)抑制率為50%時，對應(yīng)的藥物含量為半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高速逆流色譜分離制備五倍子各組分

分析型高速逆流色譜研究五倍子組分的分離體系，得到分析圖譜(圖1)，圖中有5個明顯的峰，體系乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)的分離效果良好，固定相保留率約為36%，滿足逆流色譜的分離要求。

依據(jù)分析型高速逆流色譜的試驗條件，將確定溶劑體系按比例擴大，在制備型高速逆流色譜上進行分離，圖譜見圖2，詳細(xì)的分離結(jié)果見表1。該體系溶劑在制備型高速逆流色譜上也可以分離得到5個峰(W1～W5)。W2、W3、W53個組分總含量為90.4%，是五倍子的主要組分。

圖2 制備型高速逆流色譜分離五倍子圖譜Fig.2 Chromatogram of Galla Chinensis separated by preparative HSCCC

表1 制備型高速逆流色譜分離五倍子各組分的分析結(jié)果Tab.1 Components in Galla Chinensis separated by preparative HSCCC

2.2 五倍子分離組分對無乳鏈球菌TN3L的生物活性測定

無乳鏈球菌TN3L在不同質(zhì)量濃度五倍子粗提物及各分離組分作用下的微量熱生長代謝熱譜曲線見圖3，從各熱譜圖中正常代謝曲線1可以看出，無乳鏈球菌TN3L的生長階段分別為延滯期、指數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰減期。1號空白對照組與6號溶劑對照組的菌株生長曲線差異不大，可知用于溶解五倍子的5%二甲基亞砜對無乳鏈球菌生長過程的影響不大，因此影響菌株生長的因素只有藥物濃度的大小。2～5號曲線為加入不同質(zhì)量濃度藥液的生長曲線，除組分W1外，均表現(xiàn)出一定的差異性，曲線的指數(shù)生長期出現(xiàn)越晚，Pt峰值越低，表明細(xì)菌的生長活力越低，藥物對細(xì)菌的抑制效果越佳。取圖中的各曲線指數(shù)生長期的Pt-t數(shù)據(jù)，按照1.3.4的計算方法，得出藥液質(zhì)量濃度與無乳鏈球菌TN3L生長速率k的擬合方程和半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(表2)。由圖3b可見，2～5曲線與1、6曲線基本重疊，且不能計算出半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，故五倍子組分W1對無乳鏈球菌TN3L沒有抑制效果。根據(jù)計算出的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度，得出其他組分與粗提物的抑菌強度依次為W2

圖3 無乳鏈球菌TN3L在五倍子的各分離組分作用下，測得在不同質(zhì)量濃度藥液下的生長代謝熱譜曲線Fig.3 The Power-Time curves of TN3L growth in the presence of the components from Galla Chinensis at various concentrations

表2 五倍子粗提物及各分離組分質(zhì)量濃度(c)與無乳鏈球菌TN3L生長速率(k)的擬合方程及半數(shù)抑制質(zhì)量濃度Tab.2 The relationship between the concentrations of the components separated from Galla Chinensis and growth rate constant of TN3L, and the half inhibitory concentrations.

3 討 論

本試驗采用生物熱動力學(xué)的方法初步探討五倍子粗提物及其分離組分對無乳鏈球菌TN3L的抑菌效果，篩選出具有較好抑制作用的五倍子分離組分，為漁用中藥制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。五倍子的主要有效成分為鞣質(zhì)，含量約70%，其在酸性條件下可水解為沒食子酸[6]。沒食子酸具有較好的抑菌活性，可溶于水、乙醇等溶劑中，沒食子酸在乙醇中的提取率顯著高于水提取[17]。靳恒[18]采用高速逆流色譜法在乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)等4個溶劑體系下提取五倍子的組分，發(fā)現(xiàn)分離體系乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)相較于其他3個體系，分離效果最好且最穩(wěn)定。本試驗在乙酸乙酯—乙醇—水(5∶1∶5，體積比)的溶劑分離體系下，固定相的保留率為36%，體系穩(wěn)定，符合試驗要求，作為分離五倍子組分的溶劑體系進行制備的效果良好，W2、W3、W53個組分的含量較高，是五倍子的主要組分。在實際制備分離過程中，由于五倍子成分復(fù)雜，常常會遇到幾個極性相似物質(zhì)峰在一次分離中不能有效分開的現(xiàn)象，為達(dá)到最佳的分離效果，尚需不斷尋求有效的輔助措施。試驗從分析型高速逆流色譜轉(zhuǎn)向制備型高速逆流色譜的過程中，受到溫度、轉(zhuǎn)速等工藝參數(shù)改變的影響，分離效果可能出現(xiàn)不同程度的降低，因此還需要進一步的優(yōu)化工藝條件。

微量量熱法是評價生物活性物質(zhì)抑菌效果的一種先進、靈敏的方法，微生物在代謝過程中產(chǎn)生的熱量，經(jīng)過微量熱儀的精密檢測，獲得熱功率—時間曲線，這些曲線反映了微生物的生長階段與模式、溫度變化情況、藥物的抑菌效果等。崔健等[19]使用微量量熱法研究在不同產(chǎn)地、不同顏色拳參作用下大腸桿菌(Escherichiacoli)的生長代謝曲線，發(fā)現(xiàn)均有不同程度的抑制作用。通過微量量熱法檢測五倍子粗提物及其各分離組分對無乳鏈球菌TN3L的抑制作用，發(fā)現(xiàn)在同一分離組分水平上，藥物含量越高，細(xì)菌的生長代謝熱譜曲線越平緩，生長速率常數(shù)k值越低，即藥物抑菌作用越強。在不同藥物水平上，藥物對菌株的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度越低，抑菌效果越好。五倍子粗提物及其各分離組分的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度大小依次為：粗提物

4 結(jié) 論

本試驗通過高速逆流色譜法分離出五倍子5個組分，通過微量量熱法檢測五倍子粗提物及其各分離組分對無乳鏈球菌TN3L的抑制作用，發(fā)現(xiàn)在同一分離組分水平上，藥物質(zhì)量濃度越高，抑菌作用越強。在不同藥物水平上，五倍子粗提物及其各分離組分的抑制作用依次為：粗提物>W5>W3>W4>W2。根據(jù)半數(shù)抑制質(zhì)量濃度的結(jié)果，五倍子組分W3～W5均能顯著抑制無乳鏈球菌TN3L的生長。結(jié)合制備型高速逆流色譜的結(jié)果，組分W3、W2、W5的含量最高，組分W4的含量僅為1.218%。因此，在配伍五倍子的實際應(yīng)用中，可以適當(dāng)剔除W1、W2和W4組分，保留W3和W5，達(dá)到減少用藥量、有效地進行疾病防治、降低養(yǎng)殖成本的目的。