三七、黃芪總皂苷聯合骨髓干細胞移植對糖尿病潰瘍miRNA-146a的影響

杜玉青 劉亞莉 李友山 劉鳳桐 黃天一

摘要?目的：探討三七總皂苷（PNS）、黃芪總皂苷（TSA）聯合自體骨髓干細胞治療糖尿病潰瘍對miRNA-146a的影響。方法：選取SD大鼠60只，在雙足背上制成糖尿病足模型，采用全骨髓培養加貼壁法分離、擴增至第4代的骨髓間充質干細胞，按隨機數字法將大鼠分為空白組、對照組、干細胞組、黃芪組;三七組干細胞組、黃芪組、三七組創面每日注射自體骨髓干細胞（0.3 mL/cm2），黃芪組每日加注黃芪注射液（0.3 mL/cm2），三七組每日加注血塞通（0.4 mL/cm2），7 d后處死，采用PCR法檢測miRNA-146a水平，Western blot法檢測TLR4 miRNA、NOD1 miRNA、核因子-κB miRNA的表達。結果：與對照組比較，干細胞組、黃芪組和三七組大鼠創面愈合率極顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）;與對照組比較，干細胞組、黃芪組和三七組大鼠miRNA-146a、TLR4 miRNA、核因子-κB miRNA、NOD1 miRNA表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）;與干細胞組比較，三七組miRNA-146a、TLR4 miRNA、核因子-κB miRNA、NOD1 miRNA表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：三七總皂苷、黃芪總皂苷聯合骨髓干細胞治療糖尿病足潰瘍有效，其愈合機制可能與TLR4/核因子-κB通路上調miRNA-146a的表達有關。

關鍵詞?三七;黃芪;大鼠;糖尿病潰瘍;自體骨髓干細胞移植

Abstract?Objective：To explore the mechanism of panax notoginseng saponins，total saponins of Astragalus combined with autologous bone marrow stem cell transplantation for treating diabetic ulcer on mirna-146a.Methods：A total of 60 SD rats were selected to make diabetic foot model on the dorsum of both feet.The fourth generation of bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and expanded by whole bone marrow culture and adherent method.According random number table method，the rats were randomly divided into a blank group，a control group，a stem cell group，and Radix Astragali seu Hedysar group.The wounds of Radix Notoginseng，stem cell group，Radix Astragali seu Hedysar group were injected with autologous bone marrow stem cells（0.3 mL/CM2）every day，Radix Astragali seu Hedysar group was injected with astragalus injection（0.3 mL/CM2）every day，and Radix Notoginseng group was injected with Xuesaitong（0.4 mL/CM2）every day.After 7 days，they were sacrificed.The content of miRNA-146a was detected by PCR.The expression of TLR4 miRNA，NOD1 miRNA，and NF-κB miRNA was detected by Western blot.Results：Compared with the control group，the wound healing rate of rats in stem cell group，Radix Astragali seu Hedysar group and Radix Notoginseng group increased significantly（P<0.01），and the expression of miRNA-146a，TLR4 miRNA，NF-κ B miRNA and NOD1 miRNA in stem cell group，Radix Astragali seu Hedysari group and Radix Notoginseng group increased significantly compared with the control group（P<0.05）.Compared with stem cell group，the expression of miRNA-146a，TLR4 miRNA，NF-κ B miRNA and NOD1 miRNA in Radix Notoginseng group was significantly increased（P<0.05）.Conclusion：Panax notoginseng saponins and astragalus saponins combined with bone marrow stem cells are effective in the treatment of diabetic foot ulcer，and the healing mechanism may be related to the up-regulation of miRNA-146a expression by TLR4/NF-κ B pathway.

Keywords?Radix Notoginseng; Radix Astragali seu Hedysari; Rats; Diabetic ulcer; Autologous bone marrow stem cell transplantation

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.010

糖尿病足（Diabetic Foot，DF）是糖尿病的嚴重并發癥。據統計，截肢患者每年約50%是由于糖尿病引起的，其中糖尿病患者發生的原因是足部潰瘍加重引發潰瘍面大面積感染以及壞疽[1-2]。糖尿病足在中醫學中屬于“脫疽”“消渴”范疇，多因病情纏綿難愈，傷津耗氣，氣虛則無力行血，久病脈絡瘀阻，發生脫疽，患病人群主要是中老年人，氣血漸弱，以氣虛血瘀證型多見[3]。有研究表明，黃芪總皂苷（Total Saponins of Astragalus，TSA）能抑制胰脂肪酶活性和醛糖還原酶活性，減少糖尿病的誘發因素，延緩糖尿病并發癥的病程[4]。另外，三七總皂苷（Panax Notoginseng Saponins，PNS）通過抑制轉化生長因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）抗氧化，加速細胞凋亡，其Caspase-3基因轉錄上調，減輕糖尿病腎病足細胞損害[5]。目前，利用現代生物工程技術-自體骨髓干細胞（Bone Marrow Stem Cell，BMSC）移植在臨床上治療糖尿病足掀起熱潮[6]，其主要成分是造血干細胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）和骨髓間充質干細胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSC），在缺血環境中生成平滑肌細胞和內皮細胞（Endothelial Cels，ECs）并增殖，在局部組織生成許多微細血管，重建細胞外基質，改善缺血、缺氧的下肢狀態[7]。研究發現，miRNA（microRNA）可以調控骨髓干細胞內miRNA的水平，可有效改善干細胞移植的治療效果，針對細胞分化、移植后干細胞的生存能力、血管新生及細胞凋亡等方面有著積極的作用[8]。但如何通過骨髓干細胞分化和調控促進糖尿病足潰瘍愈合的機制尚不明確。本課題旨在探究中藥三七、黃芪外治干預大鼠自體骨髓干細胞治療糖尿病潰瘍過程中，如何調控miRNA水平促進糖尿病足潰瘍愈合的機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?8周齡SPF級SD大鼠，雄性，體質量80～100 g，購自中國醫學科學院動物所，合格證號SCXK（京）2016-0001。所有動物實驗研究均符合中國中醫科學院動物倫理委員會有關動物研究指導原則。動物飼養條件：在三級動物室無菌飼料喂養，每5只1籠，溫度（25±2）℃，相對濕度（55±5）%，12 h光照晝夜循環，自由獲取食物和水。

1.1.2?藥物?黃芪注射液（神威藥業集團有限公司，國藥準字Z13020999），血塞通注射液（廣西梧州制藥股份有限公司，國藥準字Z20025652）。

1.1.3?試劑與儀器

試劑：MEM/F12干粉培養基（Gibco Invitrogen Corporation）（Sigma公司，美國，批號：1322013），鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（Sigma公司，美國，批號：3444091），血糖試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：7603061），磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）（北京百奧萊博科技有限公司，批號：3342213），椎蟲藍（上海生工公司，批號：8713518），SV總RNA分離試劑盒（Promega公司，美國，批號：2273041），反轉錄試劑盒（Promega公司，美國，批號：3357123），SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR試劑盒（ABI公司，美國，批號：KS14679），TLR4（Santa Cruz公司，美國，批號：0284381），NOD1受體（Santa Cruz公司，美國，批號：55556231），核因子-κB（Santa Cruz公司，美國，批號：4439720），ki67的抗體試劑盒（Santa Cruz公司，美國，批號：3802342）。相關引物序列由北京優博蘭基因技術有限公司合成。見表1。

儀器：熒光倒置相差顯微鏡（尼康公司，日本，型號：Ti-E/U/S），多功能酶標儀（BioTek公司，美國，型號：bio-tek ELX800），生化自動分析儀檢測（Beckman公司，美國，型號：Dxc 800），PCR儀（Applied Biosystems公司，美國，型號：7500 Real-time），圖像分析系統（Molecular Devices公司，美國，型號：MetaMorph）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

糖尿病足大鼠模型：經高脂飼料（配方：蛋黃2.5%，蔗糖20%，豬油10%，基礎飼料67.5%）飼養1個月，體質量控制在300～350 g，進行腹腔40 mg/kg注射STZ。觀察1周，取成模穩定的糖尿病大鼠，在大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1 mL/100 g進行麻醉，用電動剃須刀除去大鼠背部長毛，面積約4 cm×4 cm，在脫毛區用直徑為3 cm的圓形塑料蓋蘸龍膽紫標記造模面積，在無菌條件下剪去造模區皮膚，深達筋膜。六層醫用紗布覆蓋創面，用醫用紙膠帶包扎固定。優選60只健康成模的糖尿病潰瘍大鼠及15只空白對照潰瘍大鼠供實驗使用?？瞻讓φ战M潰瘍大鼠15只（簡稱空白組）;對照組糖尿病潰瘍大鼠15只（簡稱：對照組）;單純干細胞組糖尿病潰瘍大鼠15只（簡稱：干細胞組）干細胞+黃芪組糖尿病潰瘍大鼠15只（簡稱黃芪組）干細胞+三七組糖尿病潰瘍大鼠15只（簡稱三七組）[10]。

自體骨髓干細胞的分離、培養、標記：從SD大鼠股骨提取骨髓細胞，采用全骨髓培養加貼壁選擇法對骨髓間充質干細胞分離、擴增，對第4代的骨髓間充質干細胞進行BrdU標記，標記終濃度為10 mg/L，標記時間24 h[11];然后收集培養細胞，采用椎蟲藍拒染活細胞計數法計數活細胞數;并且取一滴懸液制作爬片。最終計數細胞時采用血細胞計數板，按照分組應用PBS緩沖細胞。

1.2.2?給藥方法?空白對照組、對照組大鼠創面不予處理，干細胞組創面注射一次自體骨髓干細胞（0.3 mL/cm2）[12]，每日清潔換藥1次，以小紗布（4 cm×4 cm）覆蓋，醫用紙膠帶包扎固定;黃芪組創面注射一次自體骨髓干細胞（0.5 mL/cm2），每日創面內注射黃芪注射液0.3 mL/cm2[13]，以小紗布（4 cm×4 cm）覆蓋，醫用紙膠帶包扎固定;三七組創面注射1次自體骨髓干細胞（0.5 mL/cm2），每日創面內注射血塞通注射液0.4 mL/cm2[14]，以小紗布（4 cm×4 cm）覆蓋，醫用紙膠帶包扎固定。7 d后將大鼠麻醉（3.5%水合氯醛1 mL/100 g），腹主動脈取血（量約8 mL）處死[15]。同時創面中心點肉芽組織2份（各5 g左右），立即冷凍于液氮中保存，用于實時熒光定量PCR法和Western blot檢測。

1.2.3?檢測指標與方法

觀察一般情況：觀察并記錄SD大鼠情況，尤其是大鼠每日的體質量數值改變。

創面愈合情況：記錄每日創面愈合面積，計算創面愈合率，創面愈合率=（給藥前創面面積-未愈合創面面積）/給藥前創面面積×100%。

熒光定量PCR法：取冰凍創面組織塊稱重后剪碎，使用一步法提取RNA，通過實時熒光定量PCR法檢測組織中miRNA-146a水平。實驗結束后，收集血管組織，SV總RNA分離試劑盒提取組織的總RNA，用反轉錄試劑盒進行逆轉錄，SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR試劑盒擴增，用相對定量表達法進行結果的定量分析。

Western blot法：收集血管組織，MBST裂解液裂解組織和抽提組織總蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，調蛋白濃度使各組一致。等量樣品上樣，SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，然后將蛋白電轉移至PVDF上電泳，依次用一抗和二抗，加入增強化學發光試劑后用感光膠片曝光。用圖像分析系統對Western blot結果進行灰度掃描，以對照組的面積灰度值為1.0與實驗組進行比較和定量分析。檢測皮膚組織中TLR4 miRNA，NOD1 miRNA和核因子-κB miRNA表達。

1.3?統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件對實驗數據進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示。符合正態分布的數據采用單因素方差分析，方差齊的數據兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?體質量?與空白組比較，糖尿病大鼠體質量顯著減小，差異有統計學意義（P<0.05）;與對照組比較，三七組、黃芪組大鼠體質量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）;與干細胞組比較，三七組大鼠體質量極顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2?創面愈合率?與空白組比較，糖尿病大鼠創面愈合率顯著減小，差異有統計學意義（P<0.05）;與對照組比較，干細胞組、黃芪組和三七組大鼠創面愈合率極顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）;與干細胞組比較，三七組大鼠創面愈合率顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.3?實時熒光定量PCR檢測皮膚組織中miRNA-146a表達?與空白組比較，糖尿病大鼠miRNA-146a表達量顯著減小，差異有統計學意義（P<0.05）;與對照組比較，干細胞組、黃芪組和三七組大鼠皮膚組織miRNA-146a表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）;與干細胞組比較，三七組大鼠皮膚組織miRNA-146a表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

2.4?Western blot法檢測皮膚組織中TLR4 miRNA，NOD1 miRNA和核因子-κB miRNA表達

2.4.1?皮膚組織中TLR4 miRNA表達?與空白組比較，糖尿病大鼠TLR4 miRNA表達量顯著減小，差異有統計學意義（P<0.05）;與對照組比較，干細胞組、黃芪組和三七組大鼠皮膚組織TLR4 miRNA表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）;與干細胞組比較，三七組大鼠皮膚組織TLR4 miRNA表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1，表5。

2.4.2?Western blot法檢測皮膚組織NOD1 miRNA表達?與空白組比較，糖尿病大鼠NOD1 miRNA表達量顯著減小，差異有統計學意義（P<0.05）;與對照組比較，干細胞組、黃芪組和三七組大鼠皮膚組織NOD1 miRNA表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）;與干細胞組比較，三七組大鼠皮膚組織NOD1 miRNA表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1，表6。

2.4.3?PCR和Western blot檢測皮膚組織核因子-κB miRNA表達?與空白組比較，糖尿病大鼠核因子-κB miRNA表達量顯著減小，差異有統計學意義（P<0.05）;與對照組比較，干細胞組、黃芪組和三七組大鼠皮膚組織核因子-κB miRNA表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）;與干細胞組比較，黃芪組和三七組大鼠皮膚組織核因子-κB miRNA表達量顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1，表7。

3?討論

潰瘍創面愈合要通過新生肉芽組織、形成新血管、膠原蛋白集聚、重建組織等過程。但是糖尿病足的潰瘍面組織分化水平降低、血管形成速度緩慢等原因阻礙潰瘍愈合，甚至日久不愈。干細胞能夠分化、增殖細胞，在潰瘍區分泌多種細胞因子，增強血管新生能力，改建微循環通路，促進創面修復。研究發現，MSC注射STZ的加強版糖尿病大鼠修復潰瘍面的速度顯著提高，其原因可能是骨髓干細胞能夠在缺血的組織中增殖、分化為血管內皮細胞和平滑肌細胞，在潰瘍組織中滿足創面愈合的血管量，增強局部潰瘍面的細胞營養以及促進壞死組織的排泄[16]。肖青青等[17]認為降低糖尿病足潰瘍面miRNA水平，會引起潰瘍的過度炎性反應發生，降低創面修復能力。

miRNA是在近些年來生物分子中探知的真核內源性RNA，是一類含有18～24 bp的非編碼單鏈分子，主要發揮調控功能[18]。miRNA裝載入RNA誘導沉默復合體（RNA Induced Silencing Complex，RISC）的單鏈miRNA經過自體局部互補（多和miRNA第2～8的Seed Sequence互補）和識別的靶分子miRNA，提高靶分子翻譯能力和穩定能力，在很大程度上降低基因表達能力[19]。miRNA-146種類分為2種，分別是miRNA-146a（5號染色體），miRNA-146b（10號染色體），其作用基本相同，目前主要研究miRNA-146a[20]。李鴻飛[21]在體內敲掉老鼠的miRNA-146a，引起血管組織完全破裂，血管內皮細胞分化、參與血運的能力下降，甚至發生嚴重壞死，說明miRNA-146a的表達調節了內皮細胞增殖，遷移及參與血形成的能力。而Bhaumik等[22]研究表明，白細胞介素、脂多糖、腫瘤壞死因子等炎性反應遞質等通過核因子-κB依賴途徑上調miRNA表達，促進血管平滑肌增殖。Toll樣受體（Toll-like Receptor，TLR）是新發現的一類天然免疫受體，對先天性免疫和獲得性免疫有積極影響。Taganov等[23]發現TLRs能夠誘導miRNA的表達，而TLR4是所有TLRs中唯一能夠經分子傳遞信號的受體。而NOD樣受體與TLRs相似，是一種新型功能胞質型固有免疫模式識別受體（PRR），最有代表性的是NODl和NOD2[24]。Franchi等[25]用NODl特異性配體刺激誘導的離體人脂肪細胞誘核因子-κB p65的核轉導，炎性反應遞質的產生顯著增加。

本實驗中，干細胞組miRNA-146a、TLR4 miRNA、核因子-κB miRNA表達量比對照組顯著增大，推測miRNA-146a是通過TLR4/核因子-κB信號通路發揮作用的。TLR4通路的激活導致miRNA-146a表達，上調的miRNA-146a又可以活化TLR4信號通路中核因子-κB上游的2個靶基因IRAKl和TRAF6，發揮對TLR信號通路的負性調控作用，減少炎性反應的過度發生，促進骨髓干細胞增殖，改善微循環，加速創面愈合。NODl miRNA表達的增加可能是NODl miRNA刺激產生炎性反應遞質，炎性遞質經核因子-κB通路上調miRNA-146a，在TLR4通路的負調節下，改善創面的炎性反應。

藥理研究表明，黃芪能促進小鼠外周血造血干細胞移植術后早期白細胞的重建[26]。而陳媛媛等[27]證實三七花總皂苷在吸收炎性物質、肉芽新生以及表皮形成等方面效用顯著。程龍等[28]表明三七總皂苷能加速大腦合成分泌堿性成纖維細胞生長因子，誘導側腦室外側壁神經干細胞的分化生長。但三七、黃芪總皂苷較骨髓干細胞移植，為何更能促進糖尿病潰瘍，其作用機制需要進一步研究。

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（2019-07-22收稿?責任編輯：楊覺雄）