電針對腸易激綜合征內臟痛大鼠β內啡肽及腦啡肽的調節作用

紀佳灝 黃作陣

摘要?目的：觀察電針對腸易激綜合征（IBS）內臟痛大鼠血清及下丘腦β-內啡肽（β-EP）及腦啡肽（ENK）的調節作用，探討電針對IBS內臟痛的鎮痛效應。方法：制備IBS內臟痛大鼠模型。實驗分為模型組、電針組、假電針組和正常組。取天樞和上巨虛穴（雙側）為針刺穴位，針刺后連接電針儀;假電針組進針透皮即止，連接電針儀但不通電。模型組和正常組做與電針組相同的固定，不進行任何治療。治療后測試各組大鼠AWR評分，檢測血清及下丘腦β-EP及ENK水平。結果：與正常組比較，模型組大鼠AWR評分在各個壓力梯度下均顯著升高、血清β-EP及ENK水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），下丘腦β-EP、ENK水平差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組、假電針組比較，電針組大鼠AWR評分明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）;血清和下丘腦β-EP、ENK水平顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，假電針組大鼠AWR評分、血清和下丘腦β-EP、ENK水平差異無統計學意義（P>0.05）。結論：電針有效緩解IBS大鼠內臟痛，其作用機制可能與調節血清和下丘腦β-EP、ENK的水平有關。

關鍵詞?電針;腸易激綜合征;內臟痛;大鼠;β-內啡肽;腦啡肽;天樞;上巨虛

Abstract?Objective：To observe the regulatory effects of electroacupuncture on serum and hypothalamic β-endorphin（β-EP）and enkephalin（ENK）in rats with IBS visceral pain，and to explore the analgesic effect of electroacupuncture on IBS visceral pain.Methods：The rat model of IBS visceral pain was prepared.The experiment was divided into a model group，an electroacupuncture group，a sham electroacupuncture group and a normal group.Tianshu（S25）and Shangjuxu（S37）acupoints（both sides）was taken as acupuncture points，and the electroacupuncture instrument after acupuncture was connected.The sham electro-acupuncture group stopped when the needle was inserted through the skin，and the electro-acupuncture device was connected but not powered.The model group and the normal group received the same fixation as the electro-acupuncture group without any treatment.After treatment，the AWR scores of each group of rats were tested，and the serum and hypothalamic β-EP and ENK contents were detected by ELISA.Results：Compared with the normal group，the AWR score of the model group was significantly increased under each pressure gradient，the serum β-EP and ENK content were significantly reduced（all P<0.01），and the hypothalamic β-EP and ENK content did not change significantly（P>0.05）.Compared with the model group and the sham electroacupuncture group，the AWR score of the rats in the electroacupuncture group was significantly reduced（P<0.05）; the serum and hypothalamic β-EP and ENK levels were significantly increased（P<0.01，P<0.05）.Compared with the model group，there were no significant changes in the AWR score，serum and hypothalamic β-EP，ENK content of rats in the sham electroacupuncture group（P>0.05）.Conclusion：Electroacupuncture can effectively relieve visceral pain in IBS rats，and its mechanism may be related to the regulation of the contents of β-EP and ENK in serum and hypothalamus.

Keywords?Electroacupuncture; Irritable bowel syndrome; Visceral pain; Rats; β-endorphin; Enkephalin; Tianshu（S25）; Shangjuxu（S37）

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.008

腸易激綜合征（Irritable Bowel Syndrome，IBS）是臨床常見的功能性胃腸疾病，主要癥狀包括腹痛并伴有排便習慣改變。調查顯示，我國人群IBS總患病率達到6.5%，發病高峰年齡段為30～59歲之間[1];亞洲IBS的發病率為2.9%～15.6%，全球10%～20%的人有IBS的臨床癥狀，約11%的成年人群深受其影響[2-3]。目前關于本病的發病機制尚不明確，研究認為其潛在機制主要與中樞神經系統、胃腸道改變、基因易感性、內臟高敏感性、腸道動力異常密切相關，其中尤其與內臟高敏感性密切相關[4-5]。內臟痛（Visceral Pain，VP）是IBS主要表現之一，也是眾多患者就診的主要原因之一。研究認為，外周傷害性感受器和中樞神經元雙重敏化是導致內臟痛的病理基礎[6]。既往研究顯示，針灸對IBS內臟痛具有良好的鎮痛作用，并初步揭示了針灸治療IBS內臟痛的作用機制[7-9]。阿片肽是一種神經活性物質，分為內源性和外源性2種[10]。內源性阿片肽是在體內合成，目前發現的內源性阿片肽主要包括5大家族：腦啡肽、內啡肽、強啡肽、孤啡肽和內嗎啡肽，對疼痛具有良好的鎮靜、鎮痛等作用[11]。本研究從阿片肽物質鎮痛角度，通過檢測大鼠血清和下丘腦中β-內啡肽（β-EP）、腦啡肽（ENK）的水平變化，并進一步探討電針治療IBS內臟痛的作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?36只出生8 d SD清潔級乳鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（京）2012-0001。所有大鼠均在北京中醫藥大學實驗動物中心飼養。平均室溫（20±2）℃、平均相對濕度（60±5）%、光照周期12 h（7：00-19：00燈照，19：00-7：00黑暗）。實驗符合相關倫理學要求。

1.1.2?試劑及儀器?大鼠β-內啡肽ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，貨號：JYM0377Ra）、大鼠腦啡肽ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，貨號：JYM0966Ra）。自制球囊;華佗牌一次性無菌針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司，規格：0.25 mm×25 mm）;韓式經穴刺激儀（南京濟生醫療科技有限公司，型號：HANS-100A）;血壓計（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，型號：水銀血壓計）;醫用三通閥（菏澤圣美高分子塑料制品有限公司）;光學顯微鏡（Olympus，日本，型號：BX53）;酶標儀（Labsystems Multiskan MS公司，芬蘭，型號：352型）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?根據Al-chaer[12]實驗方法，采用球囊刺激乳鼠直結腸（CRD）制備IBS內臟痛大鼠模型。選擇出生8 d的乳鼠，隨機分為正常組9只和造模組27只。正常組大鼠僅進行會陰部抓揉，1次/d，連續14 d;造模組大鼠每天予以CRD刺激，方法如下：在球囊表面涂液體石蠟，從肛門緩慢插入約2 cm，到達降結腸部位。球囊充氣0.2 mL，持續1 min后緩慢撤氣，取出球囊，1 h后重復1次，1次/d，連續14 d。造模結束后，飼養42 d，對所有大鼠進行CRD刺激并進行腹壁撤回反射（AWR）評分。分別予以20 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、40 mm Hg、60 mm Hg、80 mm Hg的結直腸擴張刺激。每只大鼠在每個壓力梯度下重復測量3次，每次持續約20 s，2次間隔5 min，取3次均值作為最后評分值。測試結束后，隨機選取正常組1只、造模組3只大鼠進行結腸HE染色，確認造模是否成功。

1.2.2?干預方法?剩余24只造模組大鼠隨機分為模型組（MG）、電針組（EA）和假電針組（SA），每組8只。將4組大鼠進行相同的固定，電針組取天樞和上巨虛穴（雙側）進行治療，定位依據《實驗針灸學》（李忠仁主編），進針深度均為5 mm，接韓式經穴刺激儀：疏波、頻率2 Hz、電流2 mA，30 min/次，1次/d，共7 d;假電針組進針透皮即止，連接電針儀但不通電，每次留針時間及療程同電針組;正常組及模型組大鼠不做任何治療。干預結束后對各組大鼠進行AWR評分測試。

1.2.3?取材與處理?大鼠麻醉后，取腹主動脈血液，置于離心管內保存，待取材結束后，于4 ℃離心機內離心提取血清，置于-80 ℃冰箱保存。于降結腸部剪取3 cm結腸組織，置于4%多聚甲醛內固定，用于HE染色及病理觀察。斷頭后，暴露大腦，取出下丘腦，置于液氮內保存備用。

1.2.4?檢測指標與方法?1）大鼠一般情況觀察：觀察各組大鼠的精神狀態、飲食、排便、體質量等。2）行為學檢測：AWR評分，AWR評分標準：0分：對CRD無行為反應;1分：刺激開始時大鼠偶有扭頭，CRD期間大鼠保持不動;2分：腹肌輕微收縮，無腹肌抬起;3分：腹肌強烈收縮，腹肌抬起，無盆腔及陰囊抬起;4分：身體拱起，盆腔及陰囊抬起。3）結腸組織病理學觀察：將置于4%多聚甲醛溶液中的結腸取出，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察結腸組織病理學變化。4）大鼠血清和下丘腦β-EP、ENK水平的檢測：將已制備好的血清和下丘腦提取上清液，參照說明書，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）按試劑盒操作，測定大鼠血清和下丘腦中β-EP、ENK水平。

1.3?統計學方法?采用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理。對數據做正態分布和方差齊性檢驗，符合正態分布采用均數±標準差（±s）表示;偏態分布時采用中位數表示。正態分布組采用單因素方差分析，方差齊采用最小顯著差法（LSD）比較組間差異性;方差不齊時用Games-Howell比較組間差異性。若資料不服從正態分布，采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?實驗大鼠一般情況?正常組大鼠精神狀態良好，行動敏捷，體質量增加，糞便軟硬適中，肛周干凈。模型組和假電針組大鼠食欲差，行動遲緩，體質量增長緩慢，易腹瀉。電針組大鼠精神狀態、飲食、活動能力均有不同程度改善，極少腹瀉，肛周皮毛污穢減少，體質量較模型組和假電針組明顯增加。

2.2?各組大鼠AWR評分?與正常組比較，模型組大鼠AWR評分明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，電針組大鼠AWR評分均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）;假電針組大鼠AWR評分無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。與假電針組比較，電針組大鼠AWR評分明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.3?各組大鼠結腸病理形態學觀察?各組大鼠結腸結構清晰，黏膜連續，腺體排列整齊、規則，無明顯炎性細胞浸潤，未見充血、水腫及潰瘍，提示結腸組織無炎性反應、損傷等改變。見圖2。

2.4?電針對IBS內臟痛大鼠血清β-EP、ENK水平的影響?與正常組比較，模型組大鼠血清β-EP、ENK水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，電針組大鼠在經過治療后血清β-EP、ENK水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;假電針組大鼠血清β-EP、ENK水平無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。與假電針組比較，電針組大鼠在電針治療后血清β-EP、ENK水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.5?電針對IBS內臟痛大鼠下丘腦β-EP、ENK水平的影響?與正常組比較，模型組大鼠下丘腦β-EP、ENK水平無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）;與模型組比較，電針組大鼠在經過治療后β-EP、ENK水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;假電針組大鼠β-EP、ENK水平無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。與假電針組比較，電針組大鼠在電針治療后β-EP、ENK水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3?討論

根據IBS的臨床表現，歸屬于中醫“腹痛、泄瀉”等疾病范疇，病因主要與外邪侵襲、飲食不節、情志內傷等有關，病位在腸，與肝脾胃腎等臟腑密切相關。現代醫學對本病的病機尚不明確，臨床治療主要以緩解癥狀為主。早在《黃帝內經》里面就有針灸治療腹痛、泄瀉的記載，如《靈樞·邪氣藏府病形》：“飧泄，大腸痛，巨虛上廉主之”。《針灸大全》：“腹中寒痛，泄瀉不止，里急后重，天樞二穴”。上巨虛、天樞分別是大腸經的下合穴及募穴，合募配穴，增強療效。現代臨床和實驗研究表明，采用天樞和上巨虛為主穴治療IBS內臟痛療效確切，并初步闡述了針灸治療IBS內臟痛的機制[13-15]。

Aughes于1975年首次從豬腦內分離出具有阿片樣活性的多肽，稱之為內源性阿片肽（EOP），簡稱內阿片肽。EOP的發現極大地促進了人們對中樞和外周鎮痛系統的研究。正常情況下，EOP處于靜息狀態，當機體受傷害性刺激時，脊髓背角第一神經元末梢釋放遞質，將痛覺傳至第二神經元，激活EOP鎮痛系統，釋放EOP，實現對傳入痛覺沖動的中樞性控制[16]。隨著現代醫學發展，對EOP鎮痛系統的研究也逐漸加深。不斷有研究證實，EOP鎮痛系統參與多種疼痛的發聲和發展過程。如賈旺華等[17]采用電針足三里、昆侖穴研究足底切口痛大鼠的鎮痛作用機制，結果表明電針能有效提高足底切口痛大鼠的痛閾，其作用機制可能與提高大鼠下丘腦β-內啡肽水平有關。電針三陰交、血海能有效提高痛經大鼠的痛閾，其作用機制可能與提高大鼠下丘腦、血清β-內啡肽的水平密切相關[18]。電針對神經病理性疼痛大鼠的鎮痛效應可能是通過提高大鼠下丘腦β-內啡肽和腦啡肽水平而發揮作用，表明β-內啡肽、腦啡肽參與疼痛發生和發展以及鎮痛過程[19]。內源性阿片肽廣泛參與疼痛的過程，其參與的病種隨著研究深入逐步增加，目前基于國際較為公認的研究結論“針刺釋放內源性阿片肽物質”為切入點，應用蛋白互作軟件STRING，構建了針刺阿片肽及相關蛋白相互作用網絡，預測針刺阿片肽系統的潛在治療病癥，進一步擴大了針刺對阿片肽系統的調控作用[20]。

本研究采用球囊刺激乳鼠直結腸制備IBS內臟痛大鼠模型，經造模后，模型組大鼠較正常組大鼠疼痛敏感度增加，主要表現為對結直腸擴張（AWR）刺激反應增強。經電針治療后，電針組大鼠AWR評分明顯下降，表明電針能有效提高IBS內臟痛大鼠的痛閾。對各組大鼠血清和下丘腦β-EP和ENK進行檢測，電針組大鼠血清和下丘腦β-EP和ENK水平明顯升高。

綜上所述，電針對IBS內臟痛大鼠的鎮痛機制之一可能通過促進外周和中樞鎮痛物質（β-內啡肽、腦啡肽）的釋放，激活EOP鎮痛系統，從而達到緩解疼痛的作用。

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（2019-03-19收稿?責任編輯：楊覺雄）