丁苯酞對阿爾茨海默病模型大鼠海馬CA1區GSK-3β及p-Tau蛋白表達的影響

鄧春穎 李海濱 毛文靜 李世英

[摘要] 目的 觀察丁苯酞（NBP）軟膠囊對阿爾茨海默病（AD）模型大鼠海馬CA1區絲氨酸蛋白激酶-3β（GSK-3β）、p-Tau蛋白表達的影響，探討NBP治療AD的機制。 方法 將72只雄性SD大鼠隨機分為假手術組（24只）、AD模型組（24只）、NBP治療組（24只）。采用β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）制作AD模型，假手術組注射5 μL生理鹽水。造模成功后4周，NBP治療組給予NBP與食用油混合后制成的NBP混合溶液灌胃;假手術組和AD模型組采用同等劑量的食用油進行灌胃。采用Morris水迷宮實驗比較各組大鼠穿越平臺次數。采用Western blot法分別于給藥后1、2、4和8周檢測海馬CA1區GSK-3β、p-Tau蛋白的表達情況。 結果 與假手術組比較，AD模型組大鼠各時間點穿越平臺次數顯著減少（均P < 0.05）;與AD模型組比較，NBP治療組各時間點大鼠穿越平臺次數均增加（均P < 0.05）;與假手術組同期比較，AD模型組大鼠海馬CA1區p-Tau、GSK-3β蛋白相對表達水平升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與AD模型組同期比較，NBP治療組大鼠海馬CA1區p-Tau、GSK-3β蛋白相對表達水平降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與假手術組同期比較，NBP治療組大鼠海馬CA1區p-Tau、GSK-3β蛋白相對表達水平升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 NBP可通過下調GSK-3β、p-Tau蛋白的表達，發揮對AD模型大鼠的腦保護作用。

[關鍵詞] 丁酚酞;阿爾茨海默病;絲氨酸蛋白激酶-3β蛋白;p-Tau蛋白

[中圖分類號] R741.02? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）09（c）-0016-04

Effects of Butylphthalide on the expression of GSK-3β and p-Tau proteins in CA1 region of hippocampal of Alzheimer′s disease rats

DENG Chunying1? ?LI haibin2? ?MAO Wenjing1? ?LI Shiying1

1.Department of Neurology， North China University of Science and Technology Affiliated Hospital， Hebei Province， Tangshan? ?063000， China; 2.Department of Cardiology， People′s Hospital of Zunhua， Hebei Province， Zunhua? ?064200， China

[Abstract] Objetive To observe the effects of Butylphthalide （NBP） on the expression of glycogen synthase kinase-3β （GSK-3β） protein and p-Tau protein in CA1 region of hippocampus of Alzheimer′s disease rats， and to explore the mechanism of brain protection by butylphthalide. Method Seventy-two male SD rats were randomly divided into sham operation group （24 rats）， AD model group （24 rats） and NBP treatment group （24 rats）. Aβ-amyloid 1-42 （Aβ1-42） was used to make AD model. The sham operation group was injected with 5 μL saline. Four weeks after successful modeling， NBP treatment group was given NBP mixed solution made of NBP and edible oil by gavage. The sham operation group and the AD model group were given the same dose of edible oil. Morris water maze experiment was used to compare the number of times the rats crossed the platform. Western blot was used to detect the expression of GSK-3β and p-Tau proteins in the hippocampal CA1 region at one， two， four and eight weeks after administration. Results Compared with the sham operation group， the number of rat crossing the platform at each time point in AD model group was significantly reduced （all P < 0.05）. Compared with AD model group， the number of rats crossing the platform increased at each time point in the NBP treatment group （all P < 0.05）. Compared with the sham operation group in the same period， the relative expression levels of p-Tau and GSK-3β proteins in the hippocampal CA1 area of the AD model group were increased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the AD model group in the same period， the relative expression levels of p-Tau and GSK-3β proteins in the hippocampal CA1 area of rats in the NBP treatment group were decreased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the sham operation group in the same period， the relative expression levels of p-Tau and GSK-3β proteins in the hippocampal CA1 area of rats in the NBP treatment group were increased， and the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion NBP can play a protective role on the brain of AD model rats by down-regulating the expression of GSK-3β and p-Tau protein.

[Key words] Dl-3-n-Butylphthalide; Alzheimer′s disease; Glycogen synthase kinase-3β protein; p-Tau protein

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種神經系統退行性疾病，是癡呆的主要原因[1]，以進行認知功能障礙為特征，表現為記憶力減退、言語障礙、定向力障礙等[2]，逐漸喪失生活能力，給家庭帶來沉重負擔。全球癡呆癥總人數約為2400萬，且以驚人的速度增長[3]，但目前病因尚不明確[4]，尚無特效藥物預防和延緩AD的發展。AD患者腦中過度磷酸化的Tau蛋白與微管結合能力降低，其在細胞內聚集形成神經纖維纏結，從而干擾神經元功能，并導致神經元變性壞死[5-6]。糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）與p-Tau的形成密切相關，且參與調節Tau蛋白異常磷酸化，此激酶異常激活可導致Tau蛋白過度磷酸化而產生的臨床癥狀[7-8]。丁苯酞（Butylphthalide，NBP）作為我國自主研發的新藥，主要用于治療缺血性腦血管病[9]，另外還能抑制神經細胞凋亡、抑制炎癥反應等[10]。近年有研究顯示NBP可改善AD患者的認知功能，但其具體機制尚不明確，本研究通過研究NBP對GSK-3β、p-Tau蛋白表達的影響，探討NPB治療AD的可能作用機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物

選取實驗大鼠72只，2～3月齡，健康清潔級雄性Sprague-Dawley（SD），體重250～280 g，實驗動物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號為：SCXK[京]2014-0010。實驗動物喂養于動物實驗室，室溫維持在24～26℃，濕度維持在45%～55%，12 h明暗交替光照，實驗前適應喂養1周。實驗過程中對動物操作符合科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導意見》[11]的相關要求。

1.2 藥物、試劑及儀器

NBP軟膠囊（石藥集團恩必普藥業有限公司批號：121101，規格0.1 g/粒）;兔抗大鼠GSK-3β多克隆抗體（北京博奧森生物公司，批號：12456s）;兔抗大鼠p-Tau多克隆抗體（Abcam 公司，批號ab109390）;兔二步法免疫組化試劑盒、二氨基聯苯胺顯色液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子質量標準蛋白（北京中杉生物有限公司，批號：PV-9001、K116610D、D0032-1）。石蠟組織切片機（德國LEICA公司，RM2 235）;腦立體定位儀（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司，ZH-藍星B/S）;Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）;透射電子鏡（日本HITACHI公司，H-9500）;電凝儀（張家港市航天醫療電器有限公司，JGD-50B）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 ?72只SD大鼠采用隨機數字表法分為假手術組、AD模型組、NBP治療組，每組各24只。造模成功后，將AD模型組、NBP治療組實驗大鼠再隨機分為造模后1、2、4周和8周4個亞組（每個亞組6只），假手術組隨機分成同上4個亞組。

1.3.2 模型制備 ?提前制備Aβ1-42溶液（濃度為1 μg/μL），制成凝聚狀態。通過Morris水迷宮篩選合格實驗動物。腹腔注射麻醉大鼠（10%水合氯醛，350 mg/kg），麻醉后將大鼠固定于腦立體定位儀上，選擇雙側海馬CA1區（以前囟為基準點，向后4.5 mm，中線旁開2 mm處），微量注射器與腦表面垂直，緩慢進針2 mm，AD模型組及NBP治療組均緩慢注射5 μL已配備好的聚集態的Aβ1-42溶液，留針10 min后撤出針頭，封閉骨質創口，縫合切口，手術區消毒。假手術組注射5 μL生理鹽水。

1.3.3 給藥方法 ?造模成功后4周進行下一步實驗。NBP治療組給予NBP混合溶液（NBP與食用油混合，濃度為8 mg/mL，灌胃劑量為100 g/mL），2次/d;假手術組和AD模型組亦給予灌胃處理，給予等劑量的食用油灌胃，2次/d，分別連續給藥1、2、4、8周。

1.3.4行為學測試 ?造模成功給藥后，采用Morris水迷宮實驗檢測實驗大鼠的學習記憶能力[12]。分別觀察各組實驗大鼠灌胃給藥后1、2、4周和8周穿越平臺的次數。

1.3.5 Western blot檢測 ?大鼠喂養至各個時間點后，腹腔注射麻醉大鼠（10%水合氯醛，350 mg/kg），冰臺斷頭取腦，分離出海馬組織。將取出的腦組織充分研磨后，置入15 mL離心管中，加組織裂解液，漿器中充分裂解40 min，4℃，60 mm，12 000 r/min，離心10 min，取上清液，-80℃冰箱保存備用。將蛋白定量分裝后調整蛋白濃度（800 μg/mL），加等量上樣緩沖液，沸水中煮5 min后備用。檢測方法：取等量蛋白樣品（50 μg）置于10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酸銨凝膠電泳，以濕轉法電轉移至聚偏二氟乙烯膜膜上，室溫封閉至少2 h。分別加入相應一抗，GSK-3β抗體（1∶500）、p-Tau抗體（1∶500），4℃冰箱孵育過夜，次日磷酸鹽緩沖液漂洗后加入羊抗兔二抗（1∶2000），37℃反應2 h，磷酸鹽緩沖液洗膜3次，加5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氯化硝基四氮唑藍顯色，顯色數分鐘，雙蒸餾水終止顯色，Image J軟件進行灰度值測定分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，各組間數據比較采用雙因素重復測量方差分析，以分組和時間作為雙因素方差分析的獨立因素，進行Bonferroni校正。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠學習記憶能力的檢測結果

與假手術組比較，AD模型組及NBP治療組大鼠各時間點穿越平臺次數顯著減少，差異有統計學意義（均P < 0.05）;與AD模型組比較，NBP治療組各時間點大鼠穿越平臺次數均增加，差異有統計學意義（均P < 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠海馬CA1區p-Tau、GSK-3β蛋白相對表達水平

與假手術組比較，AD模型組大鼠各時間點海馬CA1區p-Tau、GSK-3β蛋白相對表達水平升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與AD模型組比較，NBP治療組大鼠各時間點海馬CA1區p-Tau、GSK-3β蛋白相對表達水平降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與假手術組比較，NBP治療組大鼠各時間點海馬CA1區p-Tau、GSK-3β蛋白相對表達水平升高，差異有高度統計學意義（P < 0. 01）。見表2～3、圖1。

A：各組不同時間點大鼠海馬CA1區p-Tau蛋白表達灰度值;B：各組不同時間點大鼠海馬CA1區GSK-3β蛋白表達灰度值。GSK-3β：絲氨酸蛋白激酶-3β

3 討論

AD病因復雜，是一種原發性神經系統退行性疾病，以認知功能緩慢進行性下降為特征[13-14]，目前無特效方法治療此病。NBP是我國自主研發的用于治療缺血性腦血管病的新藥，研究顯示它除了可以改善循環、抗自由基外，還有抗氧化、抗炎、抗凋亡[15-16]，可以一定程度地改善患者認知功能[17-18]。本研究結果顯示AD模型組大鼠學習記憶能力下降，采用NBP灌胃治療后大鼠的學習記憶能力得到改善，與AD模型組比較，NBP治療組大鼠穿越平臺次數增加。

海馬屬于大腦邊緣系統，參與學習、記憶等過程，研究認為海馬結構及功能發生改變與認知功能密切相關[19]。結合文獻本研究采用Aβ1-42溶液向雙側海馬區注射制作AD模型，此模型受損部位明確，可迅速建立癡呆模型，較全面地模擬AD的全過程，包括病理改變及行為改變。在AD早期，海馬區首先受累，較公認的假說是該部位Aβ 淀粉樣學說和Tau蛋白學說[20]。Tau蛋白學說研究中，Tau及p-Tau蛋白是研究熱點之一。GSK3又稱 Tau磷酸化激酶，有糖原合成激酶-3α（GSK-3α）和GSK-3β兩種形式，主要存在于大腦皮質、海馬、浦肯野細胞等。GSK-3β是一種Tau磷酸化激酶，接受多種胞內信號調控，參與多種生物機能，其中包括學習記憶[21-23]。它與p-Tau蛋白的形成有關。調控GSK-3β的活性主要是AKT蛋白參與，它可抑制GSK-3β活性，當其合成障礙時，GSK-3β被激活引起Tau蛋白異常磷酸化[24]，異常磷酸化的Tau蛋白聚集形成螺旋絲，最終導致纖維纏結。有研究顯示，氧化應激反應能增加GSK-3β活性，而抑制其活性，既能緩解緩氧化應激反應，又能減少細胞凋亡[25]。本實驗采用Western blot法檢測實驗大鼠海馬GSK-3β、p-Tau蛋白的表達，結果顯示在假手術組各時間點海馬CA1區GSK-3β、p-Tau蛋白均有少量表達。在AD模型組大鼠各時間點表達均增多，4周時表達量最高，8周時稍有下降，但仍處于較高水平。而與AD模型組比較，在NBP治療組大鼠中，GSK-3β、p-Tau蛋白表達均有下降。GSK-3β、p-Tau蛋白表達的結果與行為學檢測結果一致，NBP可通過下調GSK-3β、p-Tau蛋白的表達發揮鬧保護作用。

綜上所述，NBP可以改善AD模型大鼠學習和記憶能力，其機制可能是下調GSK-3β、p-Tau蛋白的表達，從而抑制Tau磷酸化，達到腦保護作用。

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（收稿日期：2020-04-10）