水質毒性精確檢測的斑馬魚胚胎心率觀測系統

王甘翔，唐 古，彭 頔，李媛媛，楊 慶，李飛鵬,*

(1. 平湖市漁業技術推廣中心，浙江嘉興 314200；2. 上海理工大學環境與建筑學院，上海 200093)

斑馬魚胚胎對有毒有害物質非常敏感，已經成為國際上生物醫學和環境毒理學的標準模式生物，廣泛應用于常規毒性試驗、分子及細胞生態毒理研究和生物誘導效應檢測等多個方面。國際標準組織已將斑馬魚推薦為河水毒性檢測的試驗魚種，并提出了相應的標準方法(ISO 07346)；我國生態環境部亦發布了《水質 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)，適用于測定地表水、地下水、生活污水和工業廢水的急性毒性。斑馬魚飼養容易，利用其胚胎的毒性檢測方法具有節約空間、費用低等諸多優勢，因此，在生態毒理學研究和水環境檢測等領域得到了廣泛的應用[1]。在利用斑馬魚胚胎評價環境污染物毒性時，致死性反應毒理學終點是環境安全評估的一項重要指標；但是，在自然水生態系統中，污染物通常具有濃度低、種類多、成分和作用機制復雜等特點，受污染的生物通常表現為畸形、突變等非致死性反應。通過觀測經毒性物質染毒條件下魚卵胚胎心跳的情況，判斷魚卵胚胎發育的毒性效應，是評價分析毒性物質的一種重要方法，同時，胚胎的心率變化也是相對較早可檢測到的指標。

當前，針對斑馬魚胚胎的心率監測，多依賴于顯微鏡觀測的計數方法，準確性受觀測者主觀判斷的影響較大。在研究不同酒制大黃對斑馬魚胚胎發育的影響時，朱淑珍等[2]采用倒置光學顯微鏡和CCD數碼攝像機對胚胎的發育終點進行研究，統計胚胎發育全過程的死亡數和畸形數，拍照記錄發育狀態，錄像并以人工計數心率；然而，這種基于斑馬魚胚胎錄制視頻文件、以人工計數心率的方式具有工作量大、存在誤差等劣勢。此外，當前斑馬魚胚胎心跳觀測普遍采用24孔板染毒，置于顯微鏡觀測并計數胚胎心跳。在這種觀測環境下，魚卵胚胎和試驗培養液直接暴露于室內空氣中，難以保證較好的觀測條件，同時也會影響試驗的準確性[3]。計算機視覺是使用計算機及相關設備對生物視覺的一種模擬技術，能夠代替人眼對目標進行識別、跟蹤和測量，并可以進一步對圖形進行處理和分析，在水環境監測和生態學研究中逐漸開始得到廣泛應用[4-6]。針對水質毒性試驗和評價的需求，本研究基于計算機視覺技術，建立了精確檢測斑馬魚心率的自動觀測系統，并進行了初步驗證，旨在提高斑馬魚毒性檢測方法的效率和精度，為水質毒性檢測方法提供一種新思路。

1 材料與方法

試驗所用的斑馬魚購自同濟大學長江水環境教育部重點實驗室，個體長度為4～5 cm，飼養于充分曝氣的自來水中，水溫保持在(26±1)℃，pH值控制在7～8，光照/黑暗周期控制為14 h∶10 h。每日喂食2次(冷凍紅線蟲，購于上海曲陽花鳥市場)，并輔助混合干飼料喂食以增加產卵量。斑馬魚飼養3個月以上并達到性成熟后進行試驗，飼養期間活動正常、無死亡。一般，斑馬魚卵胚胎在受精24 h后(24 hpf)心臟發育成形，即可在顯微鏡下觀測到心跳[7]。

試驗前夜，在暗室內將產卵器放入魚缸，親魚按1∶2雌雄比放入產卵器內，中間用隔板隔開，下方放置魚卵收集器，次日清晨抽出隔板，光照30 min以刺激斑馬魚產卵。取出魚卵收集器，用闊口膠頭滴管(管口直徑大于卵徑)將卵吸出，然后用標準稀釋水清洗魚卵數次，以除去糞便等雜質，挑選出正常的受精卵培養備用。

標準稀釋水配置參照《水質 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)的方法進行。

2 心率觀測系統構建

2.1 心率觀測系統設計

心率觀測系統由實驗室卵胚胎培養裝置、組裝的高速攝像顯微鏡和視頻圖像心率識別程序組成。實驗室卵胚胎培養裝置結構如圖1所示。組裝的高速攝像和顯微鏡系統采用高清(1 920×1 080/50P)攝像機，在APS-C商用畫幅下能得到0.1 μm2/ Pixel(像素)的分辨率；顯微鏡采用光學倒置顯微鏡(Olympus CKX41)(圖2)。

圖1 實驗室卵胚胎培養裝置結構示意圖Fig.1 Structure Diagram of Laboratory Culture Device for Zebrafish Embyro

圖2 計算機視覺系統裝置Fig.2 Picture of Computer Visual System

為了得到較準確的斑馬魚卵胚胎心跳觀測結果，需控制觀測裝置的環境溫度、光照等因素以保證魚卵胚胎的正常發育，并防止外界污染物進入培養液，從而保證單一變量試驗，同時需保證胚胎固定穩固，以利于觀測。因此，本研究自行設計了魚卵胚胎培養裝置，由相互連通的容納單元、恒溫水流動單元組成，可固定于組裝的高速攝像顯微鏡載物臺。

容納單元腔室為圓柱形，由上蓋板、下底板、側板構成腔室，腔室與側板之間、腔室與腔室之間均留有空隙。腔室的數量設置為4個，內徑為2 cm，深度為2 cm，每個腔室均設置上部的高位換水孔和下部的低位換水孔，相錯設置，同時與側板連通。

上蓋板、下底板及腔室內均填充透光纖維團，為腔室提供一定的光源，保障觀測時的光線條件。使用中上蓋板蓋合，使得魚卵胚胎心跳觀測裝置封閉，防止外界污染。充氧的恒溫水通過高位換水孔向低位換水孔持續流動，為腔室內斑馬魚卵胚胎生存提供了充足的氧氣和恒溫水浴條件；換水孔徑較小(3 mm)使得腔室內水體流動較緩，加上腔室內填充的纖維團緩沖了水體流動對腔室造成的沖擊，腔室底部的纖維絮層固定魚卵胚胎，總體上防止了觀測中魚卵胚胎抖動影響觀測結果的準確性。

2.2 胚胎染毒方法

在對Schulte等[8]的研究方法進行改進的基礎上，采用自主設計加工的卵胚胎培養裝置(圖1)進行染毒試驗。挑選出4枚24 hpf正常受精卵置于培養裝置胚胎放置腔內，組裝好培養裝置，利用染毒試液構建恒溫水浴環境對胚胎進行染毒。

在室溫與目標溫度相近的情況下，將染毒試液由泵水管與恒溫進水口相連，控制壓力保持胚胎腔室液位穩定，不溢出。試驗時，先將位于透光上蓋板內壁上的標記黏結固定合適大小、形狀的纖維團(透光化纖)，再將進樣泵一端連接恒溫水源，進樣泵另一端連接進水孔；在進樣泵作用下，恒溫水通過進水孔進水，進入容納單元，充滿側板與腔室之間及腔室相互之間的空隙以及各個腔室，然后通過出水孔流出。控制水壓，保持腔室水位穩定后，通過吸管將卵胚胎放入腔室底部，再鋪上脫脂棉薄層，使魚卵胚胎固定在纖維絮層上，并蓋上已黏結纖維團的上蓋板，封閉腔室，隨著上蓋板蓋合，纖維團即可插入纖維絮層并填充腔室，之后將該裝置放置于倒置顯微鏡上，通過透光的下底板觀測魚卵胚胎心跳的情況，進行觀察及視頻錄制。

室溫與目標溫度相差較大會影響胚胎生理指標，此時，只需將進樣泵水管連接水體恒溫裝置后再與恒溫進水口相連即可。

2.3 視頻圖像心率識別方法

視頻文件由心率識別程序處理后得到胚胎心率指標。心率識別程序采用Matlab數學軟件編寫，通過對基于灰度變化的斑馬魚心室圖像面積的Matlab程序編碼。編寫的8組M碼文件可以組合應用于Matlab軟件，對視頻圖像文件不同部分進行黑色和白色處理，最終得到心室面積的實時變化值。心室面積變化值反映了心臟的收縮和擴張，心室面積值-時間曲線的2次波峰之間的時間間隔內即發生了1次完整的心跳。因此，通過對心室面積值-時間曲線的分析即可得到心率，從而實現心室圖像心率識別。

3 方法驗證實例

為觀測正常的斑馬魚胚胎心跳，以日常放置半天的自來水為試驗試劑，通過上述心率檢測系統進行正常環境下斑馬魚胚胎的觀測、視頻錄制和心率識別，以驗證本研究構建的觀測系統的準確性。本例所用視頻文件總時長為6 min，心率識別程序每隔0.02 s對視頻圖像進行1次處理，共得到18 000個面積數據值。

利用Excel 2013從所得的面積數據值中隨機選取5組連續5 s內的數據值，根據各面積-時間曲線圖總體趨勢，5組曲線走勢類似，且均可清晰地分辨出波峰數量，數據波峰數量均為9，隨機抽取的1組心室面積值-時間折線圖如圖3所示。為判斷心率與波峰的對應關系，對心率識別程序所用視頻文件進行人工計數，同樣采用隨機選取4組1 min時長進行計數，所得結果分別為112、105、108、114次/min，平均心率為110次/min。1 min斑馬魚胚胎平均心跳數為108次，與人工計數所得幾乎一致，波峰與心率基本吻合，說明通過構建的計算機識別程序可準確計數斑馬魚胚胎的心率變化。Park等[9]在利用斑馬魚心臟毒性模型預測藥物引起心率過緩情況時，使用立體顯微鏡對斑馬魚卵胚胎心率進行30 s人工計數，發現未染毒對照組斑馬魚卵胚胎平均心率為105次/min；Chakraborty等[10]在研究咖啡因、諾氟沙星和尼美舒利對斑馬魚胚胎心率影響時，發現空白對照組的斑馬魚卵胚胎平均心率為110次/min。斑馬魚心率觀測系統所得平均心率值與上述已有研究結果十分接近，且其結果與人工計數結果相差無幾，同時，在觀測操作和心率計數方面具有更加便捷、快速和精確的優勢。

圖3 隨機抽取的心室面積-時間曲線圖Fig.3 Random Selection of Ventricular Area-Time Curve

采用混合地表徑流樣品為試驗試劑進行培養，分別用顯微鏡人工觀測和本系統觀測斑馬魚胚胎心率。顯微鏡觀測斑馬魚胚胎發育48 h的心率為(153±13)次/min，本系統觀測的平均值為151次/min，與人工技術結果一致，進一步說明了系統觀測的準確性。

4 方法應用討論

在以斑馬魚為受試生物的環境毒理學研究中，斑馬魚胚胎心率在不同濃度染毒試劑中的變化情況已有廣泛的研究。葉露[7]采用倒置顯微鏡對斑馬魚胚胎進行15 s人工計數，得到了不同濃度全氟辛酸(PFOA)和全氟化合物(PFCs)所對應的斑馬魚胚胎平均心率值；楊洋等[11]發現了雙酚AF暴露對胚胎期的毒性效應，構建了不同濃度的雙酚AF所對應的斑馬魚胚胎平均心率；Wu等[12]在研究上海市高架道路降雨徑流水質毒性時，采用斑馬魚作為受試生物，得到了不同批次降雨徑流所對應的斑馬魚平均心率。同時，這些研究的斑馬魚胚胎心率變化構建出染毒試劑濃度和斑馬魚胚胎心率關系曲線，含有對應污染物的水質，即可通過斑馬魚胚胎心率變化進行定量化表征，從而實現水質情況的快速、實時監測。在心率計數時，人工計數的方式造成的誤差是不可避免的，且誤差大小具有不確定性，雖然同樣可以取多組人工計數求出平均心率，但由于人工計數耗時較多，數據組不可能取無限多次以減小誤差。本研究所提供的斑馬魚心率觀測系統，基于計算機視覺技術，可隨機選出足夠多組數據進行分析，從而實現心率結果誤差最小化。本研究提供的方法可在后續的研究中構建更多的水體污染物濃度與心率關系曲線，實現對水質的快速檢測。同時，斑馬魚心率觀測系統能夠更好地模擬自然環境，可以對卵胚胎發育全過程進行實時觀測和圖像提取分析，在研究胚胎發育形態方面也具有較大優勢。在對污染物濃度變化大的降雨徑流水質和毒性比較時，Chen等[13]發現，基于傳統方法的水質評價并不能完全反應降雨徑流的生態毒性水平，應考慮同時進行徑流的毒性和水質檢測。本方法可在觀測斑馬魚胚胎毒理學指標的同時，構建在線監測系統進行水體水質監測，可實現水質指標和生態毒性指標的協同在線檢測。

5 結語

本研究提供了一種斑馬魚心率觀測系統的建立方法，改進了胚胎觀測的條件，能夠更好地模擬斑馬魚胚胎發育的自然環境，從而使觀測結果更加準確；通過編寫的視頻圖像心率識別程序，與傳統人工計數方式相比，基于計算機視覺的胚胎心率計數更加高效、快速和準確；斑馬魚心率觀測系統在檢測系統中的應用驗證了系統的可行性和準確性。在具體的水質檢測應用中，可以采用斑馬魚卵胚胎在水樣中染毒，構建出心率與水質變化的規律，從而通過心率變化實現對水質和毒性的實時協同監測。