堿熱法輔助提取圓紅冬孢酵母油脂

李 強， 黃其田， 趙宗保

（1.中國科學院大連化學物理研究所 生物技術部， 遼寧 大連 116023； 2.中國科學院大學， 北京 100049）

0 引言

日益嚴峻的能源危機和能源安全形勢， 促使國家大力發展可再生能源。 生物柴油是最重要的液體可再生能源之一， 不僅在能源性質方面可取代化石柴油，還具有安全環保等優良特性[1]。 常規的生物柴油生產原料有植物油脂、 動物油脂和餐飲業廢油等， 然而以它們為原料會產生“與人爭糧，與人爭地”的問題，致使生物柴油的發展受到限制。微生物油脂具有和動植物油脂相似的組成，而且微生物油脂的生產周期短且不受氣候和環境的限制，因此，微生物油脂是生產生物柴油的潛在原料[2]。

傳統的微生物油脂生產過程包括微生物油脂發酵、菌體收集、菌體干燥和胞內油脂提取。 常用的油脂提取方法為酸熱法， 該方法以干菌體為原料，利用酸對細胞進行裂解，具有細胞破碎充分、油脂提取徹底的優點， 被認為是最有效的油脂提取方法[3]。 但是，酸熱法以干菌體為原料，干燥步驟使得該方法工藝繁瑣且能耗巨大， 增加了油脂提取成本，限制了該方法的推廣[4]。 進一步簡化微生物油脂生產工藝、降低油脂提取能耗，是推廣微生物油脂的必要條件。

近年來，為了簡化微生物油脂提取工藝，降低油脂提取能耗， 有研究者提出了采用濕菌泥直接進行油脂提取的方法，并受到廣泛關注[4]。 為了從濕菌體中有效地提取油脂， 采取合理有效的方法進行細胞破碎是關鍵。 常用的細胞破壁方法主要包括物理法、生物法和化學法。物理法主要包括微波輔助法、超聲波輔助法和玻璃珠破碎法，其中，微波輔助法是通過微波加熱使細胞壁出現破碎，以便于油脂萃取，但該方法的能耗極高；超聲波輔助法是通過超聲波加速細胞壁破碎， 但該方法不易放大，且能耗高；玻璃珠破碎法是通過玻璃珠撞擊來破碎細胞，能耗雖低，但不易于放大且油脂提取率通常低于40%，因此不能得到廣泛應用[5]～[7]。生物法主要是通過細胞裂解酶裂解細胞， 也有通過溶藻菌對細胞進行裂解，反應條件溫和，且易于放大，但裂解酶具有高度的底物選擇性，而且價格昂貴，不利于生產成本的控制[8]，[9]。 化學法主要包括酸熱法。 陳宏選考察了濃硫酸輔助提取微生物油脂的方法，并建立了動力學模型[10]。

產油酵母是生產微生物油脂的優良候選菌株，特別是圓紅冬孢酵母，它可以利用玉米秸稈水解液積累超過細胞干重60%的油脂[11]。 本文選用圓紅冬孢酵母作為生產微生物油脂的模式菌株，期望建立以濕菌體為原料， 以堿熱法輔助細胞破壁的提取微生物油脂的有效方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

圓紅冬孢酵母 （Rhodosporidium toruloides CGMCC 2.1389）購于中國通用微生物培養物保藏中心（CGMCC）。

1.2 培養基

YEPD 液體培養基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、瓊脂10 g/L，pH 值為6.0。

YEPD 固體培養基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、瓊脂10 g/L、瓊脂粉15 g/L，pH值為6.0。

批式油脂發酵培養基：葡萄糖70 g/L，酵母粉0.5 g/L，（NH4）2SO42 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。

1.3 培養方法

1.3.1 種子液的制備

將新鮮斜面活化好的圓紅冬孢酵母接種于裝有50 mL YEPD 液體培養基的250 mL 三角瓶中，并置于30 ℃，200 r/min 的搖床中培養24 h。

1.3.2 圓紅冬孢酵母批式油脂發酵

在3 L 的發酵罐中進行圓紅冬孢酵母批式油脂發酵，初始裝液量為2 L，接種量為10%，溫度為30 ℃，pH 值為5.6，通氣比（每分鐘通氣量與罐體實際料液體積的比值）為0.8，溶氧為40%～50%[2]，[3]。 在批式發酵過程中，通過流加1 mol/L 的NaOH和1 mol/L 的HCl 自動控制發酵液的pH 值。

1.4 油脂提取方法

1.4.1 酸熱法

每克干菌體加入4 mol/L 的HCl 6 mL，于78℃消化1 h；取出冷卻，加入等體積的氯仿和甲醇，充分混合萃取1 h；取氯仿層，向剩余物中加入等體積氯仿再萃取一次，取氯仿層；合并氯仿層，用等體積0.1%的NaCl 溶液洗滌； 取氯仿層用無水硫酸鈉干燥，并用氯仿洗滌3 次；真空蒸發除去氯仿，剩余油烘干稱重。

在本研究中分析油脂提取率時，假定此方法的油脂提取率為100%。

1.4.2 堿熱法

圓紅冬孢酵母油脂發酵完成后，離心收集濕菌體 （含水量為90.9%）； 按比例添加不同量的NaOH（如比例為0.15，即每克干菌體添加0.15 g的NaOH）， 于不同溫度水浴中處理不同時間，用HCl 調pH 至中性； 用等體積的有機試劑萃取2次，旋轉蒸發除去溶劑，獲得油脂，烘干稱重。

1.5 分析方法

1.5.1 脂肪酸組成分析

微生物油脂甲酯化： 稱取70.0 mg 的待測油脂，加入5%的KOH/CH3OH 溶液0.5 mL，加熱回流50 min；然后加入BF3的甲醇溶液（BF3乙醚溶液和CH3OH 的體積比為4∶10）0.7 mL， 繼續回流10 min；冷卻后加入1 mL 去離子水和0.7 mL 正己烷，混勻后吸出有機相，經去離子水洗滌兩遍后用于氣相色譜分析。

氣相色譜條件：FFAP 石英毛細管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），進樣器溫度為250 ℃，進樣量為0.5 μL；N2流速為41 mL/min，檢測器（FID）溫度為280 ℃；H2和空氣流速分別為33，100 mL/min；柱溫為190 ℃；分流進樣。脂肪酸甲酯通過對照標準樣品定性，采用面積歸一法確定相對含量。

1.5.2 中性脂組成分析

在高效薄層色譜分析儀（HPTLC，DESAGA，德國）上進行中性脂組成分析。油脂樣品在硅膠板上點樣完畢后，用展開劑（正己烷、無水乙醚和冰乙酸的體積比為80∶40∶1）展開至前沿硅膠板3 cm處， 之后用吹風機吹干硅膠板， 將染色液（H3PO4和CuSO4·5H2O 的質量體積分數分別為8%和10%）均勻噴灑在硅膠板上，然后于160 ℃加熱4 min 后取出，用540 nm 處可見光進行掃描。

1.5.3 環境掃描電鏡分析

將堿熱處理（NaOH 的添加比例為0.15，于78℃處理3 h）后的樣品和未經處理的樣品分別稀釋200 倍 （OD600=0.68）， 用環境掃描電鏡（Quanta650FEG，賽默飛世爾，美國）進行拍照。

2 結果與分析

2.1 堿熱法輔助提取油脂單因素優化

圓紅冬孢酵母生產的油脂是胞內產物， 被細胞壁和細胞膜所包裹， 須破壁后用有機溶劑進行提取。 傳統的油脂提取過程包括發酵液收集、沉降、干燥、破壁和萃取。 本研究直接以濕菌泥為原料， 用NaOH 熱輔助破壁， 再用有機溶劑進行萃取。為獲得更高的油脂提取率，須考察NaOH 添加比例、處理時間和溫度對油脂提取率的影響。

2.1.1NaOH 添加比例對油脂提取率的影響

圓紅冬孢酵母發酵完畢后， 首先在濕菌體中加入一定比例的NaOH，然后78 ℃水浴處理1 h，再用等體積的氯仿和甲醇萃取兩次， 旋轉蒸發除去溶劑， 獲得油脂。 在每克干菌體中分別添加0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，1.0 g 的NaOH 時， 即NaOH的添加比例分別為0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，1 時，圓紅冬孢酵母油脂提取率的變化如圖1 所示。從圖1可以看出： 當NaOH 的添加比例分別為0.2，0.4，0.6 時， 油脂提取率分別為24.3%，41.7%，47.0%；繼續增大NaOH 的添加比例至1.0 時， 油脂提取率仍為47.0%。 這說明在不改變其他油脂提取條件的情況下，當NaOH 的添加比例為0.6 時，細胞破壁比較充分，油脂提取率相對較高。

圖1 NaOH 的添加比例對油脂提取率的影響Fig.1 Effect of addition ratio of NaOH on lipid extraction yields

2.1.2 堿熱處理時間對油脂提取率的影響

當NaOH 的添加比例為0.15， 堿熱處理時間分別為1，2，3，4，5，6 h 時， 圓紅冬孢酵母油脂提取率的變化情況如圖2 所示。從圖2 可以看出：隨著堿熱處理時間的增加，油脂提取率逐漸增加，即細胞壁裂解程度逐漸增加；當堿熱處理時間由1 h增加到2 h 時， 油脂提取率從37.9%增加到了70.7%；當堿熱處理時間增加到3 h 時，油脂提取率升高至84.1%；之后繼續增加堿熱處理時間，油脂提取率增加緩慢， 當堿熱處理時間增加到5 h時，油脂提取率為90.9%。

圖2 堿熱處理時間對油脂提取率的影響Fig.2 Effect of alkali-heat treatment time on lipid extraction yields

2.1.3 堿熱處理溫度對油脂提取率的影響

堿熱處理溫度同樣影響堿熱處理效果， 溫度過低，無法到達破壁效果，溫度過高，容易使堿進入細胞與甘油三酯發生皂化反應， 從而降低油脂提取率。 因此， 我們考察了當NaOH 添加比例為0.15，堿熱處理時間為3 h 時，堿熱處理溫度對油脂提取率的影響（圖3）。 從圖3 可以看出：當堿熱處理溫度為68 ℃時， 油脂提取率僅為11.1%，這說明在此溫度下，NaOH 對細胞壁的破壞程度較低；當堿熱處理溫度從78 ℃升高到88 ℃時，油脂提取率由87.1%下降到了62.1%。 這可能是由于部分細胞完全裂解， 油脂從細胞中釋放出來，與NaOH 發生了皂化反應。

圖3 堿熱處理溫度對油脂提取率的影響Fig.3 Effect of alkali-heat treatment temperature on lipid extraction yields

2.2 油脂提取溶劑及條件的優化

根據相似相容原理， 最佳的萃取溶劑既要有強大的油脂萃取能力，又要有較好的極性。 因此，我們考察了萃取溶劑以及萃取時間和溫度對油脂提取率的影響，結果如圖4 所示。

圖4 萃取條件對油脂提取率的影響Fig.4 Effect of extraction conditions on lipid extraction yields

從圖4 可以看出， 萃取溶劑的選擇對油脂提取率的影響很大， 而萃取時間和溫度對油脂提取率的影響很小。與前期酶處理的結果類似，正己烷和石油醚的油脂提取率均較低，低于50%[12]。從圖4（b）可以看出：當萃取時間不小于1 h 時，油脂提取率不再隨著萃取時間的增加而增加； 當萃取溫度升高至40 ℃，油脂提取率也不再隨著萃取時間的增加而增加。根據相似相容的原理，萃取溶劑的疏水性越強，對中性脂的溶解能力就越強，萃取的油脂量就越大。 堿熱法提取油脂是在高水分體系中進行的， 大量的水在細胞周圍形成了一層極性“膜”，嚴重阻礙了疏水性溶劑向細胞內的滲透，因此，選擇合適極性的油脂有利于提高油脂提取率。乙酸乙酯、 二氯甲烷和氯仿的相對極性分別為0.259，0.309 和0.228， 對油脂的萃取率分 別為88.2%，81.0%和85.5%，即乙酸乙酯的油脂提取率最高。 此外，乙酸乙酯具有毒性小、可生物降解和對環境更加友好等特點， 是一種較為理想的油脂萃取溶劑。

2.3 單因素優化堿熱輔助提取油脂條件

進行單因素優化后， 將堿熱處理時間延長至3 h，選擇處理溫度為78 ℃，選擇更加環保的乙酸乙酯進行萃取，此時，NaOH 的添加比例對油脂提取率的影響如圖5 所示。 從圖5 可以看出，當NaOH 的添加比例為0.2 時， 油脂提取率為99.3%，比之前的24.3%（圖1）提高了3 倍。

圖5 NaOH 的添加比例對油脂提取率的影響Fig.5 Effect of addition ratio of NaOH on lipid extraction yields

2.4 堿熱處理對圓紅冬孢酵母細胞形態的影響

為了更詳細地了解堿熱法用于微生物油脂回收的原理， 使用環境掃描電鏡觀察了堿熱法處理前后圓紅冬孢酵母細胞形態的變化（圖6）。從圖6可以看出：不經任何處理時，圓紅冬孢酵母細胞呈橢球形， 細胞表面光滑且緊密； 使用堿熱法處理后，細胞壁變得粗糙且生有倒刺，但細胞并沒有塌陷或者裂解。這說明堿熱處理雖然沒有裂解細胞，但是使細胞表面變得粗糙， 部分細胞壁多糖發生斷裂，細胞壁出現空洞，促進了乙酸乙酯進入細胞與油脂結合， 從而提高了油脂提取率。 堿熱處理后，細胞結構保持完整，沒有明顯的細胞碎片，表明堿熱處理并不會裂解細胞， 只是會對細胞的表面結構產生一定影響， 胞內油脂在堿熱處理過程中并未釋放出來， 可推測堿熱處理對油脂組成的影響較小。

2.5 油脂組成分析

油脂提取方法（油脂提取條件均為加入等體積的乙酸乙酯，于30 ℃萃取30 min）對油脂中性脂組成的影響如表1 所示。

由表1 可知， 通過堿熱法和酸熱法所提取得到的油脂中均具有游離脂肪酸（FFA）、單酰基甘油 （MAG）、 二酰基甘油 （DAG） 和甘油三酸酯（TAG）。 圓紅冬孢酵母油脂的主要成分是TAG，相對含量大于70%， 其中酸熱法獲得的油脂中TAG 的相對含量較堿熱法略高；酸熱法和堿熱法提取得到的FFA 和MAG 的相對含量相差較小；堿熱法得到的油脂中DAG 的相對含量為24.5%，略高于酸熱法的15.9%。總之，堿熱法處理得到油脂的中性脂組成和含量與酸熱法相對一致。

油脂提取方法對油脂脂肪酸組成的影響如圖7 所示。從圖7 可以看出，堿熱法和酸熱法獲得油脂的脂肪酸主要由肉豆蔻酸 （C14:0）、 棕櫚酸（C16:0）、棕櫚油酸（C16:1）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）和亞油酸（C18:2）組成，這與文獻[13]的結論相一致。 兩種方法得到油脂的脂肪酸組成相同，表明堿熱法得到的油脂可用于生物柴油生產。

圖7 油脂提取方法對油脂脂肪酸組成的影響Fig.7 Effect of lipid extraction methods on composition of fatty acid

3 結論

本文建立了以堿熱法輔助破壁， 直接利用濕菌泥進行微生物油脂提取的方法， 并通過單因素條件優化， 獲得了最佳的堿熱法油脂萃取條件為濕菌泥中NaOH 的添加量為0.2 g/g，之后經78 ℃水浴處理3 h 并用乙酸乙酯萃取， 油脂提取率可達99.3%。通過環境掃描電鏡分析可知，堿熱處理使細胞壁產生較多孔洞，但細胞壁并未完全裂解，油脂并未釋放到處理液中。 這些孔洞將提高有機溶劑對油脂的萃取效率， 同時又有利于保護油脂的原始組成。 由GC 和HPTLC 分析可知，堿熱法提取得到的油脂，與酸熱法無顯著差異。 因此，堿熱法是一種以濕菌體為原料直接進行油脂提取的新方法，該方法省卻了菌體干燥的步驟，不僅可以簡化微生物油脂提取工藝， 還可以降低微生物油脂提取的能耗， 為微生物油脂技術的工業化應用打下堅實基礎。