紅心獼猴桃果酒抗氧化及抑制人肝癌HepG2細胞增殖活性研究

秦晉穎 ，謝曉林，朱 燕，許譯文，劉志剛，蔡 倪，韓 琳

（1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽 550005；2.貴州省輕工業科學研究所，貴州貴陽 550007）

貴州六盤水紅心獼猴桃果肉顏色鮮艷，口感香甜細膩，營養豐富，深受廣大消費者的喜愛。目前紅心獼猴桃市場主要集中于鮮果生產及銷售，加工產品種類和數量有限，通過紅心獼猴桃果酒開發，提升產品附加值是促進當地種植農戶增收的有效途徑。獼猴桃果酒是以新鮮獼猴桃果實或果汁為原料，經發酵而成的一種低度酒，采用原汁發酵，保留了獼猴桃水果最初的果香，酸甜適中，同時在釀造過程中，酵母代謝及酶促作用分解了部分大分子物質，使果酒中含有豐富的功能成分，入口醇厚、爽口，因風味獨特并富含多種營養物質，在眾多果酒產品中獨樹一幟，市場前景廣闊[1-3]。

盡管類型眾多的果酒打著營養保健功能的旗號大行其道，然而具體營養成分、含量及功能性并不明確，果酒賣點宣傳模糊，針對性不強。與此同時，食品已經日益成為發現生物功效成分的重要途徑，有學者對沙果果酒和葡萄酒等產品中的生物活性進行了研究[4-6]，目前有關獼猴桃果酒的生物功能研究有限，本研究以貴州六盤水紅心獼猴桃果酒為對象，對其抗氧化及抗腫瘤活性進行初步探究，以期為提升紅心獼猴桃加工產品附加值，為當地經濟發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試樣：紅心獼猴桃果酒樣品由六盤水涼都獼猴桃集團公司提供。

試劑及耗材：DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS（2,2-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽）、維生素C、沒食子酸、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、DMSO 均為分析純，乙醇、鹽酸和甲醇等，購自上海國藥集團化學試劑有限公司，試驗用水為二次重蒸水。The CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent (MTS 試劑) 和luciferase 測試試劑盒購自Promega 公司(Madison,WI,USA)。改良型DMEM 高葡萄糖培養基購買于Sigma 公司，胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco 公司，肝癌HepG2細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

儀器設備：UV-2550 型紫外可見分光光度計，日本島津公司；酶標儀，美國Thermo Electron 公司；旋轉蒸發儀，RE-52A 型，上海亞榮；MA110 型分析天平，上海良平儀器儀表；DL-166RH 型高速離心機，上海安亭科學儀器廠；SPX-250B-Z 生化培養箱，上海博訊實業有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DPPH自由基清除能力測定

參照文獻方法[5-6]，以沒食子酸為標準物質繪制標準曲線，取酒樣用乙醇稀釋20 倍，取酒樣稀釋液2.0 mL，加入0.2 mM DPPH 乙醇溶液2.0 mL，搖勻，避光靜置45 min，以乙醇為空白，于517 nm 處測定吸光度，另取2.0 mL 乙醇與2.0 mL DPPH 乙醇溶液混勻，相同波長處測定吸光度值，每份樣品平行操作3 次，根據沒食子酸標準曲線回歸方程，計算樣品清除DPPH 自由基的能力。

1.2.2 ABTS+自由基清除能力測定

參照文獻方法[7-9]，分別取250 μL、200 μL、150 μL、100 μ L、50 μ L酒樣置10 mL容量瓶中，乙醇稀釋定容。將不同濃度的酒樣2.0 mL 與2.0 mL ABTS+反應液混合均勻，暗處反應5 min，于734 nm 波長處測定吸光度值為A1，用蒸餾水代替酒樣與ABTS+混合均勻測定吸光度值為A0，依文獻中公式計算ABTS自由基清除率，并通過統計軟件計算IC50值。

1.2.3 HepG細胞活力測試

MTS 測試[10-12]：將人肝癌HepG2-C8 細胞培養于細胞培養液中（10 %胎牛血清DMEM 培養基），置于37 ℃、5%CO2培養箱培養，隨行細胞計數，待細胞計數達1×106左右，加入2.0 mL 0.25 %胰蛋白酶-EDTA 溶液于培養箱中消化細胞2 min，加入DMEM 培養基適量后轉移至離心管中，將所收集細胞液以3000 r/min 轉速離心3 min，棄掉上清液，加入細胞培養液懸浮細胞，吹打均勻，以5000 個細胞/孔接種于96 孔培養板，置于37 ℃、5 % CO2的培養箱培養24 h。

將獼猴桃果酒不同濃度提取物及陽性對照用DMSO 溶解，用1%FBS 細胞培養液稀釋成不同濃度梯度。實驗設空白組和實驗組，空白組為0.1 %DMSO 細胞培養液100 μ L；實驗組加入不同濃度（12.5 μM、25.0 μM、50.0 μM、100.0 μM、200.0 μM）果酒提取物100 μ L，每個濃度梯度設3 個復孔，在37 ℃、5 % CO2培養箱中培養24 h 后棄去培養液，每孔加入100 μ L 含適量MTS 測試液細胞培養液，鋁箔紙包裹后置于培養箱繼續培養1 h，酶標儀于檢測波長520 nm 處測定每孔吸光度值，計算細胞增殖抑制率，以上實驗組分別測試給藥1 d、3 d、5 d。

1.2.4 Luciferase-ARE測定

HepG2 細胞來源于肝癌細胞的粘附性上皮樣細胞，常用于研究細胞保護、抗遺傳毒性和協同基因毒性的工具。本研究通過測定Luciferase 活性，研究獼猴桃果酒提取物激活Nrf2信號通路的能力，從而為闡述其潛在的抗腫瘤活性作用機理奠定基礎。測試方法參考文獻[12]，用12 孔板隔夜培養HepG2-c8 細胞，以每孔1×106個細胞密度種板，萊菔硫烷（SFN）作為陽性對照，采用0.1 % DMSO 和不同濃度的獼猴桃果酒提取物處理細胞24 h，移除培養基，用PBS 清洗細胞，加入100 μ L 裂解緩沖液，經-80 ℃凍融循環后于冰臺上刮取細胞，4 ℃冷凍離心機10000 r/min 離心10 min，取上清液，加入50 μ L Luciferase 測試試劑，在Luminometer 發光儀上讀取吸光值，通過所測得BCA 蛋白濃度進行相應計算。

表1 獼猴桃果酒提取物抗氧化作用

1.2.5 數據統計分析

采用GraphPad Prism 8 軟件對數據進行統計分析，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用Student's t-test 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 紅心獼猴桃果酒抗氧化能力

從表1 中測定結果可看出，獼猴桃果酒提取物對DPPH 自由基有一定的清除能力，IC50值為58.32 μg/mL，而陽性對照VC的IC50值為11.27 μg/mL，說明其清除效果大大低于VC。同樣，獼猴桃果酒提取物對ABTS+自由基的清除能力也低于VC，其IC50值分別為32.56 μ g/mL 和5.76 μ g/mL，綜上，獼猴桃果酒提取物有一定的抗氧化活性，但效果一般。

2.2 人肝癌HepG2細胞抑制率

分別于給予獼猴桃果酒提取物第1 d、3 d、5 d進行細胞活性測定，從圖1 可看出，獼猴桃果酒提取物給藥組HepG2細胞活力均有明顯下降，且表現出時間和劑量依賴性，獼猴桃果酒提取物200 μ M處理5 d 后，HepG2 細胞活力均在70 %左右，表明獼猴桃果酒提取物對HepG2 細胞具有一定的抑制作用，該劑量被選擇用于隨后的實驗。

2.3 Luciferase-ARE測定

測定結果見圖2，可以看出獼猴桃果酒提取物誘導熒光素酶表達無劑量依賴性，與對照組相比，分別以62.5 μ M 和125 μ M 獼猴桃果酒提取物處理后，熒光素酶表達量分別為對照組的3.46 倍和3.78倍，SFN (10 μ M)陽性對照處理后熒光素酶活性大幅增加9.74 倍，與預期一致，表明獼猴桃果酒提取物可以激活Nrf2信號通路，進而調節抗氧化基因的轉錄。基于每組蛋白質濃度計算得到熒光素酶表達，與對照組相比各組間均P＜0.05，具有統計學意義。

3 討論

3.1 有文獻報道獼猴桃具有抗氧化功效[13-16]，目前對于紅心獼猴桃的研究主要集中在以VC為代表的成分測定和深加工產品開發等方面，有關其他功效成分及生物活性研究鮮見文獻報道，通過本研究發現，紅心獼猴桃果酒提取物對DPPH 自由基和ABTS+自由基具備一定的清除能力，但其清除能力較弱，與VC 相比較，獼猴桃果酒提取物沒有體現出顯著的抗氧化活性。

3.2 本研究首次對紅心獼猴桃抑制肝癌HepG2 細胞體外增殖活性進行了研究，獼猴桃果酒提取物200μ M 處理5 d 后，HepG2 細胞活力降至70 %以下，表明獼猴桃果酒提取物對HepG2細胞具有一定的抑制作用，具備潛在抗癌活性，進一步研究發現，激活Nrf2 信號通路進而調節抗氧化基因的轉錄是其抑制肝癌HepG2細胞可能的作用機理。