利那洛肽的合成

周 黎，喬春華

（蘇州大學 醫學部藥學院，江蘇蘇州 215123）

利那洛肽（Linaclotide，1）是由美國Ironwood 公司研發的一種鳥苷酸環化酶C（GC-C）激動劑[1]，于2012年8月30日獲美國FDA 批準上市，用于治療便秘腸易激綜合（IBS-C）和慢性特發性便秘（CIC），它是首個具有此種作用機制的治療便秘的藥物，被FDA 唯一批準的可用于臨床的腸道局部起效的GC-C 激動劑類藥物，也是歐洲首個獲批用于治療中重度IBS-C 成人患者的新型處方藥物[2]。1為含有三對二硫鍵的十四肽，其氨基酸序列為：H-Cys1-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH（二硫鍵連接方式為Cys1-Cys6，Cys2-Cys10，Cys5-Cys13），氨基酸序列如下：

作為一種含有多對二硫鍵的多肽，分子結構中二硫鍵的準確配對是合成1的關鍵技術[3]。通過氧化形成三對二硫鍵的時候，情況較為復雜，反應往往會錯配形成多種異構體。因此，通過選擇性氧化二硫鍵合成1可以很好地避免錯配異構體的產生。

本文采用三苯甲基（Trt），乙酰氨甲基（Acm）和叔丁基（tBu）這三種常見的可以正交保護半胱氨酸的保護基，分別通過過氧化氫，碘和PhS（O）Ph/Ch3SiCl3體系分步氧化形成三對二硫鍵[4-5]，其肽序中的三對二硫鍵Cys1-Cys6，Cys2-Cys10，Cys5-Cys13，分別使用叔丁基（tBu）、三苯甲基（Trt）和乙酰氨甲基（Acm）作保護策略。合成示意如下：

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DIONEX LCMS 質譜儀；DIONEX UltiMate 3000 型高效液相色譜儀；漢邦5cm 制備型高效液相色譜；司樂85-1磁力攪拌器；東旺TD5K 低速臺式離心機；金石6210型真空干燥箱；BUCH 旋蒸；四環冷凍干燥機；普瑞遜HT1000N 電子天平；多肽合成反應柱（定制）；

利那洛肽對照品（Linaclotide，Toronto Research Chemicals. Canada）；2-氯三苯甲基氯樹脂（2-CTC Resin，1.0mmol/g，西安藍曉科技新材料股份有限公司）；保護氨基酸（純度＞98%，成都泰和偉業生物科技有限公司）；縮合試劑（純度＞98%，蘇州昊帆股份有限公司）；色譜級乙腈（ACN，天津市康科德科技有限公司）；其余實驗所用化學試劑均為市售分析純。

1.2 1的固相合成[6-7]

1.2.1 中間體Ⅰ 的制備

稱取2-CTC Resin 樹脂（10g，1.0mmol/g）投入多肽合成反應柱中，加入DCM（150mL）溶脹30min，抽濾，除去濾液；另稱取Fmoc-Tyr（tBu）-OH（3.5g，7.5mmol）于燒杯中，加入DMF（100mL）攪拌溶解，加入DIEA（3.4mL，18mmol）進行冰浴活化，5～10min 后倒入反應柱中，20～30℃反應2h，除去液體，用DMF（3*100mL）洗滌，加入封閉液（DCM ∶MeOH ∶DIEA=80 ∶15 ∶5，體積比）100mL，封閉兩次10min，封閉結束后用DMF（4*100mL）洗滌，再用甲醇（3*100mL）收縮，每次10min，抽干樹脂，真空干燥14h得中間體Ⅰ 13.1g，替代度測定結果為0.58mmol/g。

肽鏈的延伸：將中間體Ⅰ 8.6g（5mmol）投入到反應柱中，根據Fmoc 固相多肽合成的原理，脫Fmoc 基團采用20% Pip/DMF 脫2次（5+15min），氨基酸偶聯以DIC/HOBT 為縮合體系，DMF 為反應溶劑，按3eq 投料，依次縮合Fmoc-Cys-OH、Fmc-Gly-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Cys-OH，縮合過程中采用Kaiser 法判斷反應終點，最終得線性肽樹脂 22.8g。

1.2.2 中間體Ⅱ的制備

將線性肽樹脂22.8g（5mmol）加入切割液（TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚=90/5/3/2，體積比，200mL）中，室溫切割2.5h。抽濾，濾餅用少量TFA 洗滌，合并濾液和洗液，向濾液中緩緩加入2L 冰MTBE 進行沉降，離心，棄上清液，用MTBE（3*400mL）洗滌，真空干燥14h 得中間體Ⅱ 10.72g。

1.3 1的二硫鍵配對[8-10]

1.3.1 中間體Ⅲ的制備

將得到的中間體Ⅱ 10.72g（5mmol）加入燒杯中，加入2 500mL 15%的ACN/純化水溶液，用氨水調制pH=8.0～9.0，加入過氧化氫1.5mL，室溫攪拌1h，用冰乙酸調pH=4.0左右，經制備型HPLC 純化，收集大于95%的樣品，濃縮凍干制得中間體Ⅲ 7.67g。

1.3.2 中間體Ⅳ的制備

將上步得到的中間體Ⅲ 7.67g（約4.3mmol），加入2 150mL 10%的冰醋酸/純化水溶液中，室溫攪拌，逐步滴入濃度為5mmol/L 的碘乙醇溶液至溶液呈橙紅色，保持反應1h，然后滴入濃度為0.1mmol/L 的抗壞血酸水溶液至溶液褪色，經制備型HPLC 純化收集大于95%的樣品，濃縮凍干制得中間體Ⅳ 4.58g。

1.3.3 1的制備

將上步得到的中間體Ⅳ 4.58g（約2.8mmol），加入1 400mL 三氟乙酸溶液中，依次加入二苯亞砜5.66g，三氯甲基硅烷41.85g，室溫攪拌1h，將溶液逐漸滴入7 000mL MTBE中，靜置，離心，棄上清，收集沉淀物，用適當MTBE 重復洗滌2～3次，干燥得1粗品3.24g，最后經制備型HPLC 純化收集大于95%的樣品，濃縮凍干制得12.11g，純度為98.02%。HPLC 圖譜（見圖1）與對照品（見圖2）一致，MS（ESI）：761.9[M-2H]2-。

圖1 利那洛肽樣品的HPLC色譜圖

2 結語

本文運用選擇性氧化策略，采用Trt、Acm 和tBu 保護的半胱氨酸進行利那洛肽的合成，分步氧化形成二硫鍵，有效地降低了二硫鍵的錯配率。并通過對比不同樹脂載體以及二硫鍵氧化的順序，得到一條較高收率的合成方法，為利那洛肽的合成提供借鑒。

圖2 利那洛肽標準品的HPLC色譜圖