泰樂菌素高效液相色譜檢測方法的建立

王麗霞 李生龍 陳碭桐 王君

摘要 [目的]為了更加簡便快速地檢測出產品中泰樂菌素的含量，建立了泰樂菌素高效液相色譜檢測方法。[方法]檢測波長290 nm，流速 0.6? mL/min，進樣量20 μL，色譜柱選用C 18，柱溫30 ℃，流動相選用乙腈∶甲醇∶0.025 mol/L磷酸二氫銨=25∶30∶5。[結果]進樣濃度在0.5～50.0 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系（R2=0.999 9）;回收率較高，均在80%以上，變異系數在允許范圍內（0～5%）;儀器重現性試驗中，對照品連續進樣10次，峰面積RSD為1.55%。[結論]高效液相色譜法檢測泰樂菌素及其制劑的含量準確可靠，穩定性、重復性好，精密度高，適用于獸藥企業對泰樂菌素及其制劑質量自控。

關鍵詞 泰樂菌素;高效液相色譜法;檢測方法;含量測定

中圖分類號 S859.84? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）20-0206-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.055

Establishment of HPLC Method for Determination of Tylosin

WANG Li-xia，LI Sheng-long，CHEN Dang-tong et al （Anhui Huaao Biotechnology Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 231131）

Abstract [Objective] In order to detect the tylosin content in the product more simply and quickly， a tylosin high performance liquid chromatography method was established.[Method]The detection wavelength was 290 nm，and the flow rate was 0.6? mL/min，and the injection volume was 20 μL，and the liquid chromatography was carred out by C 18，and the column temperature was 30 ℃.With the mobile phase was acetonitrile∶methanol∶0.025 mol/L ammonium dihydrogen phosphate=25∶30∶45.[Result]The injection concentration of 0.5-50.0 μg/mL had a good linear relationship with the peak area （R2=0.999 9）; the recovery rate was above 80%， and the coefficient of variation was within the allowable range （0-5%）.In the instrument reproducibility test，ten successive injections of reference，the peak area RSD was 1.55%.[Conclusion]The detection of tylosin and its preparations by high performance liquid chromatography is accurate and reliable， with good stability， reproducibility and high precision. It is suitable for veterinary drug companies to control the quality of tylosin and its preparations.

Key words Tylosin;High performance liquid chromatography;Detection method;Content determination

泰樂菌素（tylosin）是一種大環內酯類抗生素 [1]，以淡黃色或白色粉末存在，易溶于水 [2]。因其在腸道內吸收好，在體內擴散得快，在臨床上多用于治療藥物，其作用機理是能與病原微生物的核糖體結合、阻礙肽鏈增長，抑制細菌蛋白質的合成，起到殺菌作用 [3]。泰樂菌素可分為酒石酸泰樂菌素和磷酸泰樂菌素等。

泰樂菌素是支原體的首選藥，它不僅對革蘭氏陽性菌而且對部分革蘭氏陰性菌都具有很強的殺滅作用 [4]，泰樂菌素的這種特性使其成為治療畜禽疾病的常用藥物 [5]。孫志良等 [6]報道，飼料中添加20 mg/kg的酒石酸泰樂菌素對肉雞有明顯的促生長作用。陳冰 [7]用雞支原體強毒人工接種AA雛雞（14日齡），24 h后口服濃度為500 mg/L的酒石酸泰樂菌素溶液，發現雛雞成活率和增重率均達95%以上。隨著酒石酸泰樂菌素的廣泛使用，出現了許多問題，如濫用藥和不規范使用，造成了藥物殘留，美國明尼蘇達大學曾做過這樣的研究，發現許多豬肥料樣本中泰樂菌素含量高達 5.2 mg/L [8]，所以關于泰樂菌素的檢測也越來越迫切。

《中華人民共和國獸藥典》 [9]中泰樂菌素的檢測方法是采用抗生素微生物檢定法，但該方法操作繁瑣、耗時較長且對檢測人員經驗要求比較高，很難滿足獸藥生產企業實現對產品快速檢測的需求。高效液相色譜法是一種高效能、高靈敏度、快速的現代分析手段 [10]。因此，為獸藥企業能有一種簡便、快捷的方法對泰樂菌素及其制劑進行質量控制，積極摸索建立一種泰樂菌素高效液相色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑 乙腈、磷酸二氫銨、磷酸、高氯酸鈉均為分析純，甲醇為色譜純，均購于國藥集團化學試劑有限公司;鹽酸購于上海振企化學試劑有限公司。

1.2 藥品 泰樂菌素標準品由中國獸藥監察所提供;泰樂星（10%酒石酸泰樂菌素可溶性粉）由安徽華澳生物技術有限公司提供。

1.3 主要儀器

高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），Eclipse-C 18色譜柱，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，手動進樣器;DELTA 320 pH計測定儀;電子天平（METTLER TOLEDO），最高精確度為0.000 01 g;單級旋片式真空泵（溫嶺市挺威真空設備有限公司）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;高壓鍋、杯式過濾器、紫外分光光度計、恒溫箱、烘干箱（安徽華澳生物技術有限公司）。

1.4 主要試液的配制

1.4.1 0.025 mol/L磷酸二氫銨。準確稱取0.718 88 g 磷酸二氫銨于250 mL容量瓶中，先用部分超純水溶解，然后定容至刻度，搖勻，用磷酸調節其pH為2.5，待用。

1.4.2 2 mol/L高氯酸鈉溶液。稱取 28.092 g高氯酸鈉于100 mL容量瓶中，先用部分超純水溶解，然后定容至刻度，搖勻，用1 mol/L濃度的鹽酸調節pH（2.5+0.1）后，待用。

1.4.3 15%甲醇溶液。用量筒量取15 mL甲醇，另加85 mL超純水混合，搖勻，待用。

1.4.4 泰樂菌素標準儲備液。精確稱取0.050 00 g泰樂菌素標準品置于100 mL容量瓶中，先加10 mL甲醇溶解，再加超純水定容至100 mL，使溶液中含泰樂菌素500 μg/mL。

1.4.5 泰樂菌素標準稀釋液。分別吸取一定量的泰樂菌素標準儲備液置于50 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，配制成50.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL。

1.4.6 生理鹽水。準確稱取9 g氯化鈉，加入100 mL純水 溶解。

1.5 方法的建立

1.5.1 波長的確定。

用紫外分光光度計對50 μg/mL泰樂菌素標準稀釋液進行全波長掃描，根據掃描光譜確定最大吸收波長。

1.5.2 流動相的確定。流動相1（2 mol/L高氯酸鈉∶乙腈60∶40），流動相2（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液60∶30∶10），流動相3（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液50∶35∶15），流動相4（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液25∶30∶45）。上述流動相過有機濾膜并超聲處理后檢測，檢測波長為“1.5.1”確定的波長，流速為1? mL/min。

1.5.3 流速的確定。流速分別設為1.0、0.8和0.6? mL/min，取10 μg/mL泰樂菌素標準稀釋液上機檢測，液相條件為 “1.5.1”和“1.5.2”選定的波長和流動相，通過比較相應的峰面積和出峰時間等因素，確定流速。

1.5.4 提取液的確定。準確稱取0.020 0 g泰樂星于100 mL容量瓶中，分別用乙腈、40%乙腈、10%甲醇和甲醇溶解并定容，超聲溶解并過有機膜過濾，不同提取液配制的溶液重復檢測3次，記錄出峰時間與面積，與泰樂菌素標準稀釋液峰面積比較，用外標法計算回收率。

1.6 驗證試驗

1.6.1 線性范圍及建立標準曲線。取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL泰樂菌素系列標準稀釋液，分別上高效液相色譜儀檢測，每種濃度重復檢測3次，記錄峰面積和濃度，并繪制標準曲線。

1.6.2 回收率和變異系數的測定。第1組準確稱取 0.500 0 g無水葡萄糖，第2組準確稱取0.450 0 g無水葡萄糖和 0.050 0 g 泰樂菌素標準品，混勻。各組分別稱取0.050 0、 0.020 0、 0.001 0 g，用“1.5.4”中優選出的提取液定容至 100? mL，配成濃度為50、20、1 μg/mL工作液，用“1.5”中優選出的條件建立方法，上機檢測，每個濃度重復檢測5次，記錄峰面積，取平均值，計算回收率。連續做3個批次，將測得的批內和批間的色譜峰面積代入標準曲線進行校準，計算變異 系數。

1.6.3 儀器的重復性。取濃度為5 μg/mL的泰樂菌素標準稀釋液，上機檢測，檢測條件為“1.5”中優選出的條件，重復10次，計算變異系數。

1.6.4 定量限的考察。取“1.6.2”配制的濃度為1 μg/mL的工作液進行稀釋，至濃度為0.5和0.2 μg/mL，將這2個濃度分別上機檢測，檢測條件為“1.5”中優選出的條件，觀察液相色譜儀上是否有響應，并檢測其回收率和變異系數。

1.7 泰樂星的含量測定 精確稱量泰樂星0.020 0 g，用 “1.5.4”中優選出的提取液定容至100? mL，用“1.5”中優選出的液相條件上機檢測，進樣量20 μL，重復檢測3次，記錄峰面積，代入標準曲線計算含量。

2 結果與分析

2.1 波長的確定

用紫外分光光度計對50 μg/mL泰樂菌素標準稀釋液進行全波長掃描，可見其在290 nm處有最大吸收峰。

2.2 流動相的確定 泰樂菌素有A、B、C、D 4個組分，其中A峰面積最大，大約占泰樂菌素總面積的90%。從圖1可以

看出，采用流動相1（2 mol/L高氯酸鈉∶乙腈60∶40）和流動相4（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液25∶30∶45）檢測的泰樂菌素A組分峰形和分離效果比較好，采用流動相1檢測，雖然能將泰樂菌素的4個組分分開，但因重復性不好，不能采用。采用流動相4檢測出的圖譜雖然沒有采用流動相1得到的組分B、C、D峰形效果好，但因泰樂菌素的主要組分為A，所以流動相4能基本滿足泰樂菌素的液相檢測需求。

2.3 流速的確定 從表1可以看出，流速越大，保留時間越小，易受到雜質影響，峰面積降低;在流速為0.6 mL/min時，達到很好的分離，且峰面積大。

2.4 提取液的確定 比較乙腈、甲醇、10%甲醇、40%乙腈4種提取液對泰樂星產品的提取效果發現，乙腈、甲醇提取分離都沒有達到要求，無法計算回收率，10%甲醇提取的回收率為96.0%，高于40%乙腈提取的回收率（90.3%），且峰形比較好看。因此確定泰樂星的提取液為10%甲醇。

2.5 方法驗證

2.5.1 方法的線性關系。按照“1.6.1”方法操作，以標準溶液濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線（圖2），進行線性回歸， 兩者呈現良好的線性關系，得出回歸方程為y=56.289x-4.666 7（R2=0.999 9），表明標準溶液濃度在0.5～50.0 μg/mL與峰面積線性關系較好。

2.5.2 回收率和變異系數的測定。由表2可知，該方法的平均回收率均在90%以上，說明該方法準確適用，適于生產中用來檢測。由表3中日間和日內變異系數結果可知，在同一天，不同濃度進行檢測，日內變異系數均小于5%，1和 20 g/mL 的日間變異系數大于5%，說明配制的標準溶液中有效成分可能會發生降解，所以在日常檢測中，標準溶液或是樣品溶液最好現配現用，這樣才能保證結果的準確性。

2.5.3 儀器的重復性。由表4可知，儀器的重復性較好，但要保證結果的準確、一致，最好是同一人在同一時間段檢測，排除其他干擾因素。

2.5.4 定量限的測定。由表5可知，樣品含量在0.2 μg/mL時測得變異系數超過了5%，說明數據波動較大，濃度太小時回收率降低;在0.5 μg/mL時，平均回收率為85%，變異系數為3.6%，在能接受的范圍，最終確定該試驗所選方法的定量限為0.5 μg/mL。

2.6 泰樂星含量的測定 由表6可知，泰樂星中泰樂菌素的含量為9.8%，與標示量10%結果一致。

3 討論與結論

該方法的建立重點在流動相的摸索，在進行試驗之前，查閱了大量的資料，國內多是用高氯酸鈉乙腈溶液作為流動相，它能很好地分離出4個組分，但是何綺霞等 [11]的試驗結

果表明用高氯酸鈉乙腈溶液組成的流動相出現4個峰，且每次4個峰的含量不一樣，難以進行定量，故不宜采用。通過查閱資料和試驗結果可知，泰樂菌素中A組分的面積占總面積的85%以上，其他3個占有很小，所以在實際生產測量中，可以通過測定A組分含量來計算產品中泰樂菌素的含量，因此，尋找一種能有效分離泰樂菌素中A組分的流動相是該方法建立的關鍵步驟。國外報道多是用乙腈、甲醇和磷酸鹽緩沖液不同比例的配比作為流動相 [12]，雖然這種流動相分離不出4個峰，但能分離出一個最大峰進而可排除其他峰的干擾，且流動相很穩定，出峰時間快。該試驗比較發現流動相4（乙腈、甲醇、磷酸二氫銨緩沖液25∶30∶45）能很好地將泰樂菌素中A組分分離，能滿足獸藥企業對泰樂菌素日常檢測的需求。

對泰樂星提取條件的優化，綜合比較提取后的液相色譜圖譜、峰形、回收率和提取液的穩定性，最終選擇了10%甲醇作為樣品前處理的提取液。

泰樂菌素標準溶液濃度在0.5～50.0 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系（R2=0.999 9）。在準確度與適應性試驗中，對已知含量的泰樂星進行測定時，測定出來的結果與真實含量相差不大，具有很好的檢測性。儀器重現性試驗中，將泰樂菌素標準溶液重復檢測10次，得出的峰面積RSD為 1.55%，對于同一濃度的標準溶液重復10次測出的含量相差較小，在誤差允許的范圍之內，表明該方法精密度良好。與《中華人民共和國獸藥典》中關于對泰樂菌素含量的抗生素微生物檢定法相比，該研究建立的高效液相色譜法，檢測結果相對準確可靠、穩定性好、重復性好、精密度高，適用于獸藥企業對泰樂菌素及其制劑質量自控。

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