響應面法優化川澤瀉發汗工藝

羅騫昀 羅昕怡 張亞琴 文秋姝 鄧秋林 陳興福

摘要 [目的]用響應面法優化澤瀉發汗加工工藝。[方法]通過標準分轉換，以發汗澤瀉的浸出物含量、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A含量的綜合評分為考察指標，分別探究環境溫度、發汗時間和含水量對綜合評分的影響，在單因素試驗確定的優化范圍基礎上，采用3因子二次回歸正交旋轉組合設計的響應面法優化了川澤瀉的發汗工藝。[結果]川澤瀉發汗的最佳工藝條件是環境溫度45 ℃、發汗時間94 h、含水量10%，此條件下綜合評分為94.02±0.02，浸出物含量為（15.34±0.02）%，23乙酰澤瀉醇B含量為（0.06± 0.02）mg/mL，24乙酰澤瀉醇A含量為（0.02±0.01）mg/mL。[結論]該研究建立的澤瀉最佳發汗工藝能夠提高澤瀉質量，為川澤瀉的開發和利用提供可靠方法。

關鍵詞 川澤瀉;發汗工藝;響應面法;工藝優化;綜合評分

中圖分類號 R284? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2020）20-0180-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.048

Optimization of Diaphoretic Processing of Alisma orientalis by Response Surface Methodology

LUO Qian-yun，LUO Xin-yi，ZHANG Ya-qin et al

（College of Agriculture， Sichuan Agricultural University，Wenjiang，Sichuan 611130）

Abstract [Objective]To optimize the diaphoretic processing of Alisma orientalis by response surface methodology.[Method]Through the conversion of standard scores， the comprehensive scores of the extract content， Alisol B 23 acetate and Alisol A 24 acetate were used as the investigation indicators， and the effects of environmental temperature， diaphoretic time and water content on the comprehensive score were explored respectively.Based on the optimization range determined by the single factor experiment， the diaphoretic processing of Alisma orientalis was optimized using the response surface method of the three-factor quadratic regression orthogonal rotation combination design.[Result]The best diaphoretic processing of Alisma orientalis were environmental temperature 45 ℃，diaphoretic time 94 h， and water content 10%. Under this condition， the comprehensive score was 94.02±0.02， the extract content was （15.34±0.02）%， and Alisol B 23 acetate was （0.06±0.02） mg/mL and Alisol A 24 acetate was （0.02±0.01） mg/mL. [Conclusion ]The best diaphoretic processing method established on this experiment could increase the quality of Alisma orientalis，providing reliable method for the expansion of the market.

Key words Alisma orientalis（Sam.）Juzep.;Diaphoretic processing;Response surface methodology;Processing optimization;Comprehensive grade

澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥塊莖為常用大宗藥材。現代藥理研究表明，澤瀉具有利尿、降血脂、降血糖、抗炎等功效，對心血管和免疫系統也具有一定的藥理作用。澤瀉也是六味地黃丸等中成藥的主要原料之一，每年的需求量6 000～8 000 t，應用廣、出口量大，具有廣闊的市場前景。澤瀉為著名川產地道藥材，主要產于四川、福建和江西，分別稱為川澤瀉、建澤瀉和江澤瀉，川澤瀉目前已占澤瀉市場用量的70%～80%。澤瀉質量是市場開發的關鍵，其質量指標主要包括灰分、浸出物、23乙酰澤瀉醇B。萜類成分24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B是澤瀉主要的利尿活性成分，常用于評價澤瀉品質和相關藥物生產。《中國藥典》（2015年版）規定，澤瀉藥材中醇溶性浸出物的含量不能低于10% [1]，有研究發現市場上的川澤瀉醇浸出物含量達標準，但其含量較建澤瀉低6%左右;建澤瀉中23乙酰澤瀉醇B含量較高，而川澤瀉中24乙酰澤瀉醇A含量較高 [2-3]。因此，優化和改善川澤瀉的加工工藝是進一步提高川澤瀉市場競爭力的重要途徑。

“發汗”是中藥材產地加工中常用的方法之一。“發汗”是將鮮藥材加熱或半干燥后，密閉堆積發熱，使其內部含水量向外蒸發，并凝結成水珠附于藥材的表面，其目的是加快藥材的干燥，有利于藥材的保存，適用于澤瀉、厚樸、杜仲等藥材。研究表明，“發汗”加工過程會在一定程度上對藥材的外表性狀、內在成分含量、藥用療效等方面有影響 [4]。通過市場調研得知，川澤瀉主要藥效成分含量也能夠通過“發汗”得以提高，但產地發汗方法不規范、工藝參數還有待通過試驗探究優化。該研究以川澤瀉為研究對象，針對目前澤瀉生產上發汗的實際情況，通過試驗探究影響川澤瀉質量的3個因素即環境溫度、發汗時間和含水量，并利用響應面法優化發汗工藝，以期為提高川澤瀉質量和功效奠定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試原料。川澤瀉，產地為四川眉山市彭山區，經四川農業大學陳興福教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥塊莖。

1.1.2 主要儀器。安捷倫1120 4286AA高效液相色譜儀，安捷倫公司;101-A3型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海捷呈有限公司;萬能高速粉碎機，廣東旭朗機械設備有限公司;FT10-2高速臺式離心機，北京金洋萬達科技有限公司。

1.1.3

主要試劑。24乙酰澤瀉醇A、23乙酰澤瀉醇B標準品購買于成都格利普生物科技有限公司;甲醇和乙腈（色譜純），購買于南京化學試劑股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1

灰分含量測定。參考《中國藥典》（2015年版）“通則2302灰分測定法”中第一法測定 [1]。平行測定3次，即得。

1.2.2

浸出物含量測定。參考《中國藥典》（2015年版）“通則2201浸出物測定法”中第二法測定 [1]，平行測定3次，即得。

1.2.3

23乙酰澤瀉醇B、24乙酰澤瀉醇A的含量測定。

1.2.3.1

標準溶液的制備。分別精密稱取適量24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B標準品于15 mL容量瓶中，加入 10 mL乙腈定容，搖勻，得到24乙酰澤瀉醇A母液濃度為 0.02 mg/mL，23乙酰澤瀉醇B母液濃度為0.03 mg/mL。

1.2.3.2

供試品溶液的制備。精密稱取澤瀉粉末0.2～ 0.5 g置離心管中，加入乙腈10 mL，密塞，超聲處理（75 W，45 kHz）20 min，冷卻，在4 000 r/min條件下離心20 min，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.3.3

樣品測定。采用高效液相色譜法測定樣品中的24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B含量。色譜條件：色譜柱為Eclipse Plus C 18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為乙 腈-水（V∶V=78∶22）;流速0.8 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長 208 nm;進樣量10 μm。

1.2.4

浸出物綜合評分方法。采用標準分轉化的方法進行試驗綜合評分 [5]。浸出物、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A為澤瀉的主要質量指標，因此以這3個指標的綜合評分作為響應面試驗設計中的響應值。對不同條件下發汗澤瀉的浸出物、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A含量進行標準分轉化，因該試驗各指標最大值為最優，最大值計為100分，最小值計0分，根據藥典各成分含量要求及實際應用價值，將浸出物權重比例設置為40%，23乙酰澤瀉醇B設置為50%，24乙酰澤瀉醇A設置為10%。各試驗項的得分（Xi）=100×（Xi-X min）/（X max-X min）。各指標結果按此公式轉化為標準分后，按指標權重比例得到綜合評分，其計算公式為： Xi=50%×100×（X 1i-X 1min）/（X 1max-X 1min）+40%×100×（X 2i-X 2min）/（X 2max-X 2min）+10%×100×（X 3i-X 3min）/（X 3max-X 3min），式中，X1為浸出物，X2為23乙酰澤瀉醇B，X3為24乙酰澤瀉醇A。

1.2.5 單因素試驗。《中國藥典》（2015年版）中明確說明“發汗”加工法的操作方法，即直接將一定量的中藥材堆積，進行“發汗”。該研究模擬藥材真實發汗環境，全程用培養箱嚴格控制溫度條件。

1.2.5.1

環境溫度對發汗效果的影響。澤瀉多于秋末冬初進行采收和加工，發汗常于室外進行。在澤瀉樣品含水量為15%、發汗時間為72 h條件下，該試驗在培養箱嚴格控制溫度穩定的情況下，分別考察發汗時環境溫度為15、25、35、45、55 ℃時對澤瀉質量綜合評分的影響。

1.2.5.2

發汗時間對發汗效果的影響。取干燥澤瀉適量，在環境溫度為25 ℃、含水量為15%條件下，分別考察發汗時間為24、36、72、108、144 h時對澤瀉質量綜合評分的影響。

1.2.5.3

含水量對發汗效果的影響。取干燥澤瀉適量，當澤瀉含水量分別為10%、15%、20%、25%、30%時，均在25 ℃條件下發汗72 h，考察不同原料澤瀉的含水量對澤瀉質量綜合評分的影響。

1.2.6 響應面法優化澤瀉發汗工藝。

1.2.6.1

響應面法優化工藝。根據單因素考察結果得到初步優化范圍，采用響應面試驗設計，對同一批次澤瀉藥材在培養箱內進行發汗處理，以浸出物、24乙酰澤瀉醇A和23乙酰澤瀉醇B含量的綜合評分為響應值，對環境溫度（A）、發汗時間（B）、含水量（C）3個因素進行優化。對試驗數據進行二次多項式回歸擬合分析（Design-Expert 8.0.6軟件），剔除影響不顯著因素后，得到其數學模型。利用上述模型和方程分析預測最佳發汗工藝參數。

1.2.6.2

顯著性檢驗。對回歸方程進行方差和顯著性 分析。

1.2.6.3

模型的驗證。根據回歸模型優選出的最佳工藝，在此條件下進行驗證試驗，測定3次平行試驗的綜合評分，觀察是否與預測值吻合，從而表明該試驗所建立的數學模型的可靠性。

2 結果與分析

2.1 灰分和浸出物的含量測定

試驗測得供試品中灰分含量均小于5%，浸出物含量均大于10%，符合藥典規定標準。

2.2 23乙酰澤瀉醇B、24乙酰澤瀉醇A的含量測定

標準品和供試樣品的測定結果見圖1。由圖1可見，供試品中含有測定目標成分，即在保留時間8 min左右出現24乙酰澤瀉醇A的峰，18 min左右出現23乙酰澤瀉醇B的峰，因此測定數據可用于進一步分析。

2.3 單因素試驗

2.3.1

環境溫度對發汗效果的影響。由圖2a可知，隨環境溫度的增加，綜合評分呈先上升后略下降的趨勢，環境溫度為45 ℃時，綜合評分達到最高值。這可能是環境溫度的升高能夠增強澤瀉內源酶活性，從而促進相關的生化反應，當溫度達到一定值后，可能會由于熱脅迫而刺激澤瀉的發汗產物進一步轉化成次級代謝產物，如萜類等，從而對質量綜合評分產生影響 [6]。試驗中發現15 ℃條件下澤瀉無發汗表現，55 ℃條件下發汗澤瀉表現出發霉嚴重的情況，因此選取25、35、45 ℃為后續優化試驗的3個水平。

2.3.2

發汗時間對發汗效果的影響。由圖2b可知，隨發汗時間增長，綜合評分呈先上升后略下降的趨勢。這可能是隨發汗時間延長，發汗過程中的生理生化反應進行得更徹底，從而提高了藥材質量。試驗研究發現，發汗時間為108 h時澤瀉出現輕微發霉現象，至144 h時發汗澤瀉發霉嚴重，因此選擇36、72、108 h為后續優化試驗的3個水平。

2.3.3

含水量對發汗效果的影響。由圖2c可知，隨含水量的增加，綜合評分呈先上升后下降的趨勢。這可能是含水量對澤瀉內部酶活性有一定影響。試驗發現10%含水量條件下發汗澤瀉無明顯發汗表現，30%含水量條件下發汗澤瀉出現較嚴重發霉情況，因此選擇10%、15%、20%為后續優化試驗的3個水平。

2.4 響應面法優化澤瀉發汗工藝

2.4.1 回歸分析。經回歸分析得到響應面數學模型：

Y= 54.55-8.13A+3.18B-0.64C+4.36AB-22.15AC-7.00BC- 1.70A2-22.60B2-7.21C2。由表1綜合評分結果分析，最佳發汗工藝參數為環境溫度25 ℃、發汗時間72 h、含水量20%，此條件下綜合評分為86.31。結合上述回歸模型分析預測，最佳發汗工藝參數為環境溫度45 ℃、發汗時間94 h、含水量10%，此條件下綜合評分為93.10。

由圖3中的三維響應曲面圖可得，發汗時間和含水量對整個發汗工藝影響顯著，環境溫度對整個工藝影響不顯著，環境溫度和含水量交互作用顯著。

2.4.2

顯著性檢驗。對回歸方程進行方差和顯著性分析，結果發現，模型的F=7.60、P=0.007 0，說明選用的模型具有顯著性。發汗時間和含水量的二次項的P<0.05，說明發汗時間和含水量對整個發汗工藝影響顯著;環境溫度及其二次項的P>0.05，因此環境溫度對整個工藝影響不顯著。環境溫度和含水量交互項的P<0.05，表明溫度和含水量交互作用顯著，其他因素間的交互作用不顯著。這與圖3顯示的結果基本一致。

2.4.3

模型的驗證。根據回歸模型優選出的最佳工藝，在此條件下進行驗證試驗，3次平行試驗的綜合評分為94.02± 0.02，此時發汗澤瀉浸出物含量為（15.34±0.02）%，23乙酰澤瀉醇B含量為（0.06±0.02）mg/mL，24乙酰澤瀉醇A含量為 （0.02±0.01）mg/mL，與預測值吻合，表明該試驗所建立的數學模型準確可靠，優化出的一體化最佳工藝重現性好，表明該最佳工藝切實可行、可操作性強。

3 結論與討論

發汗時間、環境溫度和含水量的交互效應對澤瀉發汗工藝效率影響均較為顯著。該試驗以環境溫度、發汗時間和含水量為考察因素，以浸出物、23乙酰澤瀉醇B和24乙酰澤瀉醇A含量加權所得到的綜合評分為指標，通過響應面優化試驗建立澤瀉發汗加工的最佳工藝為環境溫度45 ℃、發汗時間94 h、含水量10%。得到的最佳工藝數據對澤瀉產地加工中的發汗過程有重要指導意義，以此可規范澤瀉發汗加工方法，也可為建造產地發汗加工設施與加工設備提供參考，以提高澤瀉加工的產業化水平。

該試驗研究了影響發汗效果的主要關鍵因素。發汗過程受到溫度、水分、時間、堆積量等條件因素的影響 [7]，該研究選擇了溫度、水分和時間3個因素進行探究，主要基于堆積量通過溫度、水分影響發汗效果，根據具體條件在有效控制溫度、水分情況下，選擇適宜的規程量。于凡等 [8]在探究不同發汗條件對丹參品質影響的研究中采用了溫度和水分2個相同探究因素，也得到顯著結果，說明通過改變發汗條件提高中藥材品質的方法具有普遍可行性。其他中藥材如杜仲等，產地加工中進行發汗處理，也得到與該試驗研究相同的效果。

“發汗”是提高藥材產地加工質量的一種有效方法，藥材發汗加工后多有外觀性狀和化學成分的變化 [3]。近年來關于“發汗”對藥材影響方面的文獻主要涉及化學成分和藥理作用2個方面 [9]，如厚樸經發汗加工過程后，厚樸酚總量比未發汗前增加了7.94% [10]，續斷發汗后用于治療白血病的活性物質川續斷皂苷Ⅵ的含量也有一定提升 [11]。該試驗研究也證實了通過發汗能夠提高澤瀉質量。目前研究者們對發汗加工的研究方向多集中在觀察加工過程前后中藥材活性有效成分的含量變化，且多數研究也表明發汗過程對藥材化學成分含量有一定的影響，為以后對發汗更深入的研究提供了較好的試驗基礎，未來對發汗的研究應轉向對其過程中內在作用機制的探究，從而為發汗加工法在市場中推廣和產地應用提供可靠的理論依據 [12]。