不同方法對海棠葉表皮的觀察對比

陳奕凝 譚文文 彭冶 白瑪玉珍 楊美鈺 劉從敏 嚴袖

摘要 為了比較不同海棠葉表皮結構的差異并選擇出最佳觀察方法，選取西府海棠（Malus micromalus）、湖北海棠（Malus hupehensis）及垂絲海棠（Malus halliana），使用撕取法、指甲油印跡法、白膠印跡法、氫氧化鈉離析法及水楊酸甲酯透明法，對不同種海棠的葉表皮進行觀察比較并以撕取法為對照對不同方法進行歸納總結。結果顯示：3種海棠葉片上下表皮結構基本相似，上表皮均具有蠟質紋飾，氣孔器均為不規則類型。湖北海棠的葉片結構和垂絲海棠較相似，其表皮細胞數據受方法影響不大。撕取法的清晰度最高;指甲油印跡法操作方便，但會使表皮細胞產生皺縮，不同類型的指甲油試驗結果存在差異;白膠印跡法難以復刻葉表皮結構細節;氫氧化鈉離析法對時間的要求很高，效果僅次于撕取法;水楊酸甲酯透明法在透明不同樹種時效果差異較大。綜上所述，撕取法適合西府海棠類較易撕取葉表皮的植物，氫氧化鈉離析法適用于如垂絲海棠難以撕取葉表皮的植物，指甲油印跡法可以用于快速觀察植物氣孔形態，水楊酸甲酯透明法受材料限制嚴重，白膠印跡法不適用于葉表皮結構觀察。

關鍵詞 葉表皮觀察;撕取法;印跡法;離析法;海棠

中圖分類號 Q944.56? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2020）20-0127-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.20.034

Observation and Comparison of Crabapple Leaf Epidermis by Different Methods

CHEN Yi-ning， TAN Wen-wen， PENG Ye et al

（College of Biology and Environment， Nanjing Forestry University，Nanjing，Jiangsu 210037）

Abstract In order to compare the differences of epidermis structure of different crabapple varieties and select the best method of observation， we selected Malus micromalus， Malus hupehensis and Malus halliana， using direct peeling method， nail polish blotting method， white glue blotting method， NaOH isolation method and methyl salicylate（MeSA） clearing method to observe and compare the leaf epidermis of different crabapples. To compare different methods with direct peeling method to summarize their characteristics. The results showed that both epidermis structures of three crabapples were basically similar. Upper epidermis had wax pattern， and stomatal apparatus was irregular. The leaf structure of M. hupehensis was like that of M. halliana， and its epidermal cell data were not affected by the method. Direct peeling method had the best clarity. Nail polish blotting method was convenient to operate， but the epidermis cells were shrunken， and the results of different types of nail polish were different. It is difficult to reproduce the details of leaf epidermis by white glue blotting method. NaOH isolation method had high demands on time， and the final effect was similar to the direct peeling method. The transparency of MeSA clearing method was various in different tree species. In conclusion， direct peeling method is suitable for the plants which are easy to peel leaf epidermis such as M. micromalus. NaOH isolation method is suitable for plants like M. halliana， which are difficult to peel the leaf epidermis. Nail polish blotting method can be used to quickly observe the stomatal morphology of plants. MeSA clearing method is seriously restricted by materials. White glue blotting method is not suitable for the observation of leaf epidermis.

Key words Observation of leaf epidermis;Direct peeling method;Blotting method;Isolation method;Crabapple

近年來全球環境的不斷變化，高溫等極端天氣增多，隨之而來的干旱、強光照等情況都對城市綠化樹木的生存構成威脅。海棠作為常見的觀賞樹種在我國應用非常廣泛，道路、公園、小區、庭院等均有種植 [1-2]。探究其對惡劣環境的適應性，有利于栽培管理。

葉片表皮結構特征在植物適應極端環境的研究中占有十分重要的地位。氣孔是葉片表皮結構的重要組成，作為植物葉片與外界進行氣體交換的主要通道，在植物光合作用、呼吸作用和蒸騰作用等方面具有非常重要的生理意義。氣孔面積、氣孔密度和氣孔指數等數據也常被用來作為衡量植物抗逆性的指標 [3]。

不同植物由于葉片性狀不同，適用的觀察方法也不同。目前，觀察植物葉表皮一般使用撕取法、刮制法、印跡法和離析法等方法 [3-5]。由于指甲油印跡法的操作簡單，因此使用頻率逐漸升高。試驗使用3種性質不同的指甲油分別制片觀察，對比其使用效果。

我國是海棠屬植物的分布中心 [6]，但是原生種的保存與利用長期不受重視;目前只有西府海棠（Malus micromalus）、湖北海棠（Malus hupehensis）、垂絲海棠（Malus halliana）等少數幾個種類有實際應用 [7]。西府海棠和垂絲海棠是我國特有植物，作為觀賞植物已有很長的歷史 [8-10]。西府海棠主要分布在我國北方地區。湖北海棠除了具有觀賞價值外 [11]，還是重要的蘋果砧木 [12]，原產于湖北 [13]，主要分布在我國中部地區 [14]。試驗選取不同方法對這3種海棠葉表皮結構進行觀察分析，并對幾種方法特性進行歸納，以期為后續海棠抗逆性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

西府海棠、湖北海棠、垂絲海棠葉片均采自南京林業大學校園內。

1.2 方法

1.2.1 撕取法。

取新鮮海棠葉片，用鑷子直接撕取葉片上下表皮置于滴過清水的載玻片上，蓋上蓋玻片，敲除氣泡， 鏡檢。

1.2.2 指甲油印跡法。

選用名創油性指甲油06亮油（油性頂油）、悅詩風吟生機指甲底油（油性底油）、名創一米陽光水性撕拉型指甲油01透明色（水性指甲油）對葉片表皮細胞進行復刻。取新鮮的海棠葉片，在不同葉片的上下表面涂抹 6 cm2 透明指甲油（2次，每次半刷：甲油刷提起后在瓶口刮去一半）。待指甲油完全干燥后撕下制片，進行觀察。

1.2.3 白膠印跡法。

取新鮮的海棠葉片，在葉片表面厚涂一層白膠[得力白膠（No.9070）]，剛好純白色不透明的厚度為宜。晾干后，制片觀察 [3]。

1.2.4 氫氧化鈉離析法。

取新鮮的西府海棠葉片，用刀片去除上端1/3和下端1/3，在中間1/3主脈兩側各切下1 cm× 1 cm 的葉片。將小葉片放入盛有70%FAA固定液的小瓶中進行固定。試驗當天進行70%、50%、30%乙醇的梯度復水。在純水中靜置后，將小葉片放入裝有3%氫氧化鈉的離心管中進行水浴加熱解離20 min [15]。取出小葉片，刮去其上表皮和葉肉組織，制片觀察。

1.2.5 水楊酸甲酯透明法。

取“1.2.3”中同時固定的小葉片，用70%乙醇洗滌3次，每次30 min。隨后80%、85%、90%、95%、100%乙醇脫水，每梯度1 h，20 min換一次乙醇。乙醇∶水楊酸甲酯（3∶1、1∶1、1∶3）各濃度梯度過渡1 h后用純水楊酸甲酯浸泡至葉片可透光 [16-17]。

1.3 葉片表皮觀察與數據處理

在40倍物鏡下，每種樣品選取3個視野進行觀察，每個視野選10個氣孔測量其直徑與寬度，10個表皮細胞測量其面積。

試驗均使用尼康50i研究級顯微鏡觀察并拍照，使用Photoshop CS6進行數據測量前處理，使用Image J（1.52a）進行數據測量，使用SPSS 25進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 3種海棠葉表皮結構特征

由圖1可知，3種海棠的上、下表皮細胞結構基本相似，上表皮均具有蠟質紋飾，細胞面積均大于下表皮。垂絲海棠與湖北海棠的上表皮細胞較西府海棠更大，并且更不規則，鑲嵌結構更加明顯。

3種海棠的氣孔器均為不規則氣孔類型 [18-19]，由2個腎形的保衛細胞和若干副衛細胞組成;副衛細胞與普通表皮細胞未有明顯不同，氣孔保衛細胞兩極有“T”型加厚。3種海棠的氣孔在葉片下表皮分布不均勻，不同位置氣孔密度不同（表1）。 湖北海棠的保衛細胞中具有更多的內含物。

方差分析結果表明，垂絲海棠和湖北海棠在葉片表皮結構上具有更強的相似性。

2.2 不同制片方法獲得的顯微圖像比較

如圖2D、3D所示，在使用撕取法獲得的圖像中，氣孔和表皮細胞形態清晰可見，輪廓邊緣十分明朗，并且依稀可見胞內內含物。

指甲油印跡法得到的圖像在顯微鏡相稱模式下極具立體感。2種油性指甲油呈現的圖像（圖2A、2B）沒有顯著區別，均可提取清晰的上表皮細胞紋飾并較為精準地復刻氣孔形態，但是無法呈現出清晰的細胞邊界，圖像中下表皮細胞難以辨認（圖3A、3B）。使用水性指甲油得到的圖像（圖2C、3C），無論是上表皮還是下表皮都不夠清晰，存在邊緣線渙散和部分區域變形等問題。

白膠印跡法成膜效果非常好，干燥后易撕取。但由于各種原因無法完成聚焦得到較清晰的圖片，故在此未 展示。

水楊酸甲酯透明法試驗中，只有湖北海棠葉片透明的效果較好（圖2E），轉換焦平面可依次觀察上表皮細胞、葉肉細胞等。其余2種海棠使用這種透明方法均不成功。

氫氧化鈉離析法得到的圖像（圖3E）顏色不太干凈，部分葉肉組織難以去除對聚焦產生影響。整體效果與撕取法差

不多，可見較清晰的氣孔和表皮細胞形態及輪廓。

上述幾種制片方法除白膠印跡法外都可以清晰呈現出氣孔形態。撕取法的清晰度極高，可以提供表皮細胞和氣孔數據的無障礙測量。從表2、3中可以看出：氫氧化鈉離析法的清晰度僅次于撕取法，但制片時間較長;其測量數據與撕取法對比存在部分差異。指甲油印跡法的制片時間更短、定位性更高，但是其測量數據分析后與撕取法存在較大差異。

在此次試驗中，湖北海棠的測量數據似乎受方法影響不大，推測與其葉表皮特性有關（表3）。

3 討論

3.1 撕取法

通過對試驗過程和數據處理結果的綜合對比，撕取法在顯微測量方面展現出更大的優勢。撕取法結合熟練刮除手法，可以得到較完整、近全透明的葉片上下表皮用于觀察氣孔和葉片表面其他形貌特征，清晰的圖像也使數據測量十分方便。同時，未經過藥品處理的葉表皮所提供的形態和尺寸信息更接近真實，也更具有說服力。在需要對數據進行精準測量的時候，建議使用撕取法。

3.2 印跡法

相比撕取法的“原件”，指甲油印跡法中用于

觀察的是“復刻件”。油性指甲油會使下表皮細胞皺縮，圖像失真十分嚴重;其中油性底油較頂油形成的油膜較脆，撕取時容易開裂;水性指甲油本身性質柔軟，在撕取制片過程中容易變形。由于印跡法通過覆膜進行表面信息提取，并通過油膜不同厚度的成像，“復刻件”圖像本身存在誤差;后期測量時，由于細胞的邊緣存在模糊，會使誤差更大。雖然不建議在需要精準數據時使用指甲油印跡法，但是這種方法方便，在快速觀察氣孔形態和提取葉片表面紋飾方面還很優秀，在3種指甲油中油性頂油的效果最好。

白膠溶于水，且溶解速度非常快，制片時會在極短時間內產生渾濁。若用無水乙醇進行制片，膠膜會收縮打卷，鏡檢效果不好，不能復刻出葉片表面的細節，不建議使用。

3.3 水楊酸甲酯透明法

用水楊酸甲酯對葉片進行整體透明，成功時的圖像非常有趣。雖然清晰度比不上撕取法，但呈現出的細胞形態不錯，基本會保持在植物細胞的生活狀態;缺點是不是所有植物的葉片都可以順利被透明。

3.4 氫氧化鈉離析法

氫氧化鈉離析法的操作過程十分繁瑣，對受試樣品和操作者都有較高的要求。前期固定和復水的時間較長，樣品進入氫氧化鈉水浴后，會出現發黑的情況：小葉片變得漆黑不透明，無法分清葉片上下表面;進行指定面表皮提取的障礙非常大。經離析后的葉片表皮不可以整張剝離，需要配合刮除手法清理葉肉細胞。出于時間考慮，不推薦使用。

4 結論

通過對5種方法的比較，撕取法制取的表皮區域是隨機的，定位性較差，但是具有清晰度高、真實性強等特點，可用于數據測量，適合西府海棠這樣葉脈較少、容易撕取葉片表皮的植物。氫氧化鈉離析法的定位性好，不受材料限制，雖然操作繁瑣，但適合像垂絲海棠這樣不易撕取葉表皮的葉片。水楊酸甲酯透明法的清晰度、定位性和真實度都十分可觀，但是受材料限制嚴重，具體使用條件還需要再繼續探索。指甲油印跡法中效果最好的是油性頂油，可用于快速觀察氣孔形態;指甲油會使表皮細胞皺縮，雖然可能對湖北海棠類似葉片的影響不大，但仍然不建議用于數據測量。不推薦使用白膠印跡法。

試驗發現，分布相似的湖北海棠和垂絲海棠在葉表皮形態結構上明顯更具有相似性，而分布在較北方的西府海棠的葉表皮結構與前兩者的差異較大，更小的氣孔密度也許意味著更強的抗逆性。選擇最合適的海棠葉表皮觀察方法得到精確的顯微結構，對進一步研究不同海棠的抗逆生理具有重要的輔助作用。同時，了解其葉片表皮結構與環境的關系，有利于對不同品種海棠區別應用，特別是作為城市綠化植物的栽培管理和蘋果嫁接砧木方面的選擇。

參考文獻

[1] 武春霞，楊靜慧，索何鳳，等.3種海棠葉片解剖結構與抗旱性的關系[J].天津農業科學，2016，22（12）：11-14，27.

[2] 邢英麗，姜永峰，唐世勇，等.北方城市觀賞海棠品種及在園林綠化中的應用[J].農業科技通訊，2010（2）：161-163.

[3] 楊芳，蒲訓.被子植物葉片氣孔制片方法研究[J].現代農業科技，2010（22）：33-34，37.

[4] 方純嬌，韓雪，史冬燕，等.牡丹葉片氣孔觀察方法的比較研究[J].安徽農業科學，2016，44（13）：41-42，76.

[5] 葉春秀，莊振剛，李有忠，等.棉花葉片氣孔制片方法比較及改良[J].分子植物育種，2014，12（3）：543-546.

[6] 劉志強，湯庚國.南京地區垂絲海棠品種分類研究[J].南京林業大學學報（自然科學版），2004，28（1）：101-106.

[7] 唐菲，丁增成，任杰，等.我國觀賞海棠種類及品種概述[J].安徽農業科學，2015，43（16）：190-195，218.

[8] 劉云鵬.寧南山區西府海棠栽培管理技術[J].寧夏農林科技，2018，59（6）：24-25.

[9] 李艷輝.西府海棠在北方園林中的應用[J].綠色科技，2018（17）：129-130.

[10] 曹穎，韓儀善.垂絲海棠栽培管理與觀賞應用[J].農業開發與裝備，2016（7）：153.

[11] 何秀娟，邱文明，徐育海.湖北海棠觀賞型新品系篩選研究[J].湖北林業科技，2014，43（4）：5-8.

[12] 邱文明，何秀娟，徐育海.矮化型湖北海棠種質資源評價與鑒定[J].中國南方果樹，2014，43（4）：104-106，110.

[13] 俞德浚.中國果樹分類學[M].北京：農業出版社，1991.

[14] 陳琳琳，吳瑞姣，劉連芬，等.湖北海棠的研究進展及應用前景[J].北方園藝，2013（16）：217-221.

[15] 溫壽星，郭祥桃，黃鏡浩，等.觀察柑橘葉片表皮細胞與氣孔結構的簡易制片方法[J].東南園藝，2016，4（6）：21-23.

[16] 陳慶亮，翟志席，楊重軍，等.肉蓯蓉種子和胚的整體透明染色技術研究[J].中草藥，2005，36（10）：1559-1561.

[17] 李彥坤，臧鞏固，趙立寧，等.整體透明技術觀察懸鈴葉苧麻胚胎發育的方法研究[J].中國麻業科學，2011，33（3）：142-146.

[18] 楊芳，蒲訓.植物氣孔類型初步分類考證[J].現代農業科技，2010（22）：193-196.

[19] 金延明，李勝華，蔡少青.中藥材中常見氣孔類型與特征鑒別[J].中國中藥雜志，1994，19（5）：267-268.