基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的地榆升白片對白細(xì)胞減少癥的作用機(jī)制研究△

劉金壘，但文超，2*，何慶勇，許博文，2，曲藝，2

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

白細(xì)胞減少癥(leukopenia)是指外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)<4×109個/L[1]的一種常見血液病，其發(fā)病率可達(dá)12.36%[2]。其臨床病因復(fù)雜，最常見于腫瘤患者因放療、化療后造血干細(xì)胞損傷所致的骨髓抑制狀態(tài)[3]，進(jìn)而使自身外周血白細(xì)胞數(shù)量減少。臨床表現(xiàn)多為乏力、倦怠、精神萎靡不振、發(fā)熱、睡眠差、食欲下降，以致腫瘤患者機(jī)體抵抗力低下，易感染，甚至導(dǎo)致治療中斷。

目前治療白細(xì)胞減少癥的臨床一線藥物如利血生、重組人粒細(xì)胞刺激因子等，其升高白細(xì)胞療效不穩(wěn)定，單獨(dú)用藥成本高昂，而且常伴隨多種并發(fā)癥，存在臨床安全評價(jià)不良的弊端[4]。因此白細(xì)胞減少癥的治療亟待尋求一種價(jià)格相對低廉，療效穩(wěn)定的藥物。

伴隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程不斷加速，天然藥物的獨(dú)特優(yōu)勢通過不同劑型得以發(fā)揮。地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥的優(yōu)勢不斷得以驗(yàn)證[5-6]。地榆升白片的成分主要為地榆，輔料為蔗糖?；A(chǔ)研究表明，地榆的主要成分為地榆皂苷、鞣質(zhì)、大黃酚、胡蘿卜苷、β谷甾醇及兒茶素等[7]，而鞣質(zhì)和皂苷類成分被認(rèn)為是地榆發(fā)揮其升白效果的主要活性成分。目前國內(nèi)外對其分子活性的研究雖相對深入，但對其在機(jī)體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)方式與途徑等方面研究尚待深入[8]。本研究借助中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，系統(tǒng)地分析地榆的有效活性成分和潛在作用靶點(diǎn)，探討其發(fā)揮升白作用可能的作用機(jī)制，為今后的實(shí)驗(yàn)研究提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 地榆活性成分的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺[9](traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、TCM-MESH數(shù)據(jù)庫[10]、ETCM數(shù)據(jù)庫(the encyclopedia of traditional Chinese medicine)[11]以獲取地榆的全部成分，將獲得的成分錄入TCMSP平臺以匹配信息，篩選活性成分條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[12]，根據(jù)已有文獻(xiàn)整理出地榆升高白細(xì)胞的成分并對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充。通過PubChem(https：//pubchem. ncbi. nlm.nih.gov/)獲取活性成分sdf分子結(jié)構(gòu)，并在SwissTargetPrediction平臺[13]預(yù)測其潛在靶點(diǎn)。

1.2 構(gòu)建地榆升白片“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

地榆“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)主要通過軟件Cytoscape 3.7.1[14]來構(gòu)建與分析，其中用“節(jié)點(diǎn)”(node)表示成分或靶點(diǎn)，用“邊”(edge)表示兩者之間的關(guān)系；采用Cytoscape 3.7.1軟件內(nèi)置的network analyzer分析工具分析網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)，包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closenesss)等，研究地榆中較為重要的成分和靶點(diǎn)及之間的關(guān)系。

1.3 白細(xì)胞減少癥相關(guān)靶點(diǎn)檢索

利用“l(fā)eukopenia”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫[15]、OMIM數(shù)據(jù)庫[16]、DisGenet數(shù)據(jù)庫[17]、TTD數(shù)據(jù)[18]、DigSee數(shù)據(jù)庫[19]、DrugBank數(shù)據(jù)庫[20]等疾病基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索與篩選，將得到的靶點(diǎn)匯總并去除重復(fù)值，再根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測到的有效成分的已知靶點(diǎn)，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將所得靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

通過BisoGenet構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將地榆活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入BisoGenet內(nèi)，各自生成PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape中的Merge功能提取2個PPI網(wǎng)絡(luò)的交集網(wǎng)絡(luò)并運(yùn)用CytoNCA[21]分析交集網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點(diǎn)的屬性值。計(jì)算連接度的中位數(shù)k1并選出連接度大于2倍k1的所有節(jié)點(diǎn)，即“Hit hubs”。計(jì)算Hit hubs網(wǎng)絡(luò)各個節(jié)點(diǎn)的屬性，分別得到連接度中心性(degree centrality，DC)、緊密度中心性(closeness centrality，CC)、介度中心性(betweenness centrality，BC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(network centrality，NC)和局部邊連通性(local average connectivity，LAC)的5個中位數(shù)k2、l2、m2、n2、o2，選出節(jié)點(diǎn)屬性同時(shí)滿足>k2、l2、m2、n2、o2的所有節(jié)點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.5 通路富集分析

Metascape平臺(http：//metascape.org)[22]可對靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，該平臺整合了GO、KEGG、Uniprot等多個權(quán)威的功能數(shù)據(jù)庫，支持對批量基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋、富集分析及構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺進(jìn)行GO及KEGG分析，保存其結(jié)果并通過R軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 地榆活性成分及靶點(diǎn)獲取

從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取到41個地榆成分，根據(jù)OB和DL參數(shù)篩選初步獲得13個成分，剔除4個未查詢到靶點(diǎn)的成分，并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充地榆皂苷Ⅰ與地榆皂苷Ⅱ[23-24]，最終獲得11個活性成分。運(yùn)用TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測模型對上述11個成分作用靶點(diǎn)加以預(yù)測。若TCMSP未納入該成分靶點(diǎn)信息，則登入Pubchem網(wǎng)站下載該成分sdf結(jié)構(gòu)信息，并通過Swiss Prediction網(wǎng)站進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，將預(yù)測結(jié)果補(bǔ)充進(jìn)上述靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果中。11個活性成分見圖1和表1。

注：藍(lán)色圓代表全部41個成分；黃色圓代表OB篩選；紅色圓代表DL篩選。圖1 ADME篩選結(jié)果活性成分分布

表1 地榆升白片中候選活性成分

2.2 地榆升白片“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

利用相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測技術(shù)對上述活性成分進(jìn)行作用靶點(diǎn)預(yù)測，排除重復(fù)靶點(diǎn)，共獲得預(yù)測靶點(diǎn)109個。利用Cytoscape 3.7.1對地榆活性成分及其作用靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制和分析，共獲得120個節(jié)點(diǎn)(包含109個靶點(diǎn)和11個活性成分)與161條關(guān)系，圖中節(jié)點(diǎn)的大小代表相應(yīng)的度值，節(jié)點(diǎn)面積越大代表度值越大，表示涉及的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越高，見圖2。

注：圖中綠色代表活性成分作用的靶點(diǎn)；藍(lán)色代表11個活性成分。圖2 地榆活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 白細(xì)胞減少癥相關(guān)靶點(diǎn)檢索

檢索Genecards、OMIM、Disgenet、TTD、DigSee和DrugBank 6個疾病數(shù)據(jù)庫，分別得到靶點(diǎn)個數(shù)為1112、13、245、0、0和1。將得到的靶點(diǎn)匯總并去除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到1204個疾病靶點(diǎn)。

2.4 地榆治療白細(xì)胞減少癥的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

2.4.1地榆治療白細(xì)胞減少癥的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.7.1中的BisoGenet功能，分別構(gòu)建地榆和白細(xì)胞減少癥的PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)地榆潛在靶點(diǎn)可與5178個靶點(diǎn)產(chǎn)生直接或間接作用，而這些靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系可達(dá)130 414種。與此同時(shí)，對白細(xì)胞減少癥相關(guān)的靶點(diǎn)繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，顯示與其直接或者間接相關(guān)的靶點(diǎn)可達(dá)10 818個，這些靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系可達(dá)224 920種，兩者交集網(wǎng)絡(luò)見圖3。

圖3 地榆升白片與白細(xì)胞減少癥的PPI網(wǎng)絡(luò)交集網(wǎng)絡(luò)

2.4.2地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 為獲取PPI網(wǎng)絡(luò)中更豐富的節(jié)點(diǎn)連接信息以及優(yōu)化節(jié)點(diǎn)信息傳遞效率，充分明確在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用的靶點(diǎn)，本研究計(jì)算了上述PPI交集網(wǎng)絡(luò)圖的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征屬性值。通過2次篩選，共獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)167個，具體篩選策略見圖4，最終篩選得到的靶點(diǎn)互相作用關(guān)系見圖5。

圖4 地榆升白片干預(yù)白細(xì)胞減少癥關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的篩選策略

圖5 地榆升白片核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

由于PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白的作用是相互的，所以通常歸為無向圖。PPI復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中存在部分密度較高的區(qū)域稱為community或module。module內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)是PPI網(wǎng)絡(luò)的潛在子網(wǎng)，子網(wǎng)連線密度較高，區(qū)域部分連線少，因此module被認(rèn)為是具有生物學(xué)意義的集合，該集合有2種含義，一為蛋白質(zhì)復(fù)合體(protein complex)，即多個蛋白質(zhì)共同組成復(fù)合體而后發(fā)揮生物學(xué)作用；一為功能模塊(functional module)，如位于同一通路的蛋白質(zhì)，其相互作用更加密切。故為更精確地分析地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥的作用機(jī)制，在得到核心PPI網(wǎng)絡(luò)后，有必要進(jìn)一步識別其內(nèi)在module。通過分子復(fù)合物檢測算法對相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，得到module，見圖6。根據(jù)P值，分別保留PPI網(wǎng)絡(luò)與module中3個最佳評分的生物學(xué)進(jìn)程并對其進(jìn)行功能描述，見表2。

注：A～F為具有生物集合意義的6個功能團(tuán)。圖6 地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥核心PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部潛在module網(wǎng)絡(luò)

表2 地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥的PPI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部潛在module功能描述(前3位)

2.5 地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥通路富集分析可視化

本研究使用Metascape平臺對上述167個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析，包括GO的BP(biological process)、CC(cellular component)、MF(molecular function)以及KEGG通路，保存其結(jié)果并使用R語言繪制氣泡圖(bubble chart)，結(jié)果見圖7。氣泡顏色由紅到紫代表lgP值從小到大，lgP值越小代表顯著性越強(qiáng)，氣泡越大代表該通路的基因計(jì)數(shù)(count值)越大，橫軸代表該通路基因所占總體輸入基因的比率(ratio)。

圖7A表明地榆調(diào)控白細(xì)胞減少癥主要涉及的生物學(xué)過程有DNA修復(fù)(DNA repair)、RNA剪接(RNA splicing)、翻譯(translation)、mRNA分解過程(mRNA catabolic process)、細(xì)胞周期過程的調(diào)控(regulation of cell cycle process)等。這些過程直接作為細(xì)胞修復(fù)和細(xì)胞增殖的環(huán)節(jié)，表明地榆對于白細(xì)胞的修復(fù)和產(chǎn)生具有直接的調(diào)控作用。

圖7D為KEGG通路富集結(jié)果，圖中顯示了排名前20的信號通路，包括剪接體通路(spliceosome)、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控(regulation of actin cytoskeleton)、細(xì)胞周期通路(cell cycle)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)通路等，此外還包括地榆與白細(xì)胞減少癥間接相關(guān)的信號通路諸如細(xì)胞間緊密連接(tight junction)、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解(ubiquitin mediated proteolysis)等。

注：A. GO-BP分析；B. GO-CC分析；C. GO-MF分析；D. KEGG分析。圖7 地榆治療白細(xì)胞減少癥作用靶點(diǎn)富集氣泡圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)并沒有與白細(xì)胞減少癥對應(yīng)的病名，但其典型癥狀如乏力、頭暈、精神萎靡、食欲減退、面色蒼白或萎黃等與明·李梴所著《醫(yī)學(xué)入門》中的虛證記載“食少神昏，精不榮，筋骨酸痛”較為接近，故可將其歸于中醫(yī)學(xué)“虛勞”范疇[25]。由圖2可知，地榆升白片調(diào)治白細(xì)胞減少癥的主要成分可能為槲皮素、地榆皂苷、山柰酚等。其中地榆皂苷I可調(diào)控F2、JUN、GLI1、HSD11B2、HSD11B1、BCL2L1等靶點(diǎn)，而靶點(diǎn)如F2可與多個活性成分互相作用，這反映出地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥的相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素可與HSP(70和90)、MAT2A和FOXM1相互作用來促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和凋亡[26]，山柰酚能以濃度依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制多藥耐藥性[27]，實(shí)驗(yàn)研究表明，地榆皂苷I可顯著升高骨髓抑制小鼠白細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞數(shù)量，激發(fā)其造血干細(xì)胞自噬的發(fā)生，并顯著上調(diào)造血干細(xì)胞中Atg5、Atg7和Beclin-1蛋白的表達(dá)水平[21]，地榆皂苷II通過激活3大細(xì)胞凋亡通路來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，間接對白細(xì)胞減少癥起治療作用。

3.1 關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)果分析

本研究按照篩選策略共得到167個潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)度值排名，其中較為重要的有FUS、CUL5、NPM1、HNRNPA1、HSPA5、H2AFX、TUBG1?；A(chǔ)研究表明，F(xiàn)US參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA剪接與轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞生命活動[28]，其主導(dǎo)的DNA或RNA結(jié)合蛋白能在DNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中促進(jìn)D-環(huán)形成和同源重組，進(jìn)而影響細(xì)胞生命活動[29]。CUL5具有結(jié)合泛素蛋白連接酶的功能[30]，其參與的ERBB2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可參與激活核糖體RNA基因的轉(zhuǎn)錄來增強(qiáng)翻譯和細(xì)胞生長[31]，這在固有凋亡信號通路中起調(diào)控作用[32]。NPM1能調(diào)節(jié)中心體復(fù)制，并通過抑制EIF2AK2/PKR自身磷酸化來抑制細(xì)胞凋亡[33]，故推測地榆升白片可能通過抑制NPM1的功能來對抗白細(xì)胞減少癥。而γ-微管蛋白(TUBG1)是人類細(xì)胞中心體實(shí)現(xiàn)組裝功能所需的必要蛋白質(zhì)，同時(shí)γ-微管蛋白還參與細(xì)胞胞質(zhì)分裂的協(xié)調(diào)[34]。熱休克蛋白5(HSPA5)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制中起關(guān)鍵作用[35-38]，而組蛋白家族成員(H2AFX)在維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性方面很重要[39]。以上研究表明，地榆升白片通過多靶點(diǎn)對白細(xì)胞減少癥起到調(diào)治作用。

3.2 通路與生物進(jìn)程分析

地榆升白片調(diào)治白細(xì)胞減少癥涉及DNA修復(fù)、mRNA分解過程、RNA剪接、DNA代謝過程的調(diào)控、細(xì)胞分裂等多個生物學(xué)進(jìn)程，這些進(jìn)程是細(xì)胞修復(fù)和細(xì)胞增殖的直接環(huán)節(jié)。細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)(regulation of cellular response to stress)的下游信號通路聚集在TSC1/2，TSC1/2可抑制對細(xì)胞生長功能具有促進(jìn)作用的雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mTORC1)。當(dāng)給予細(xì)胞的刺激達(dá)到一定程度時(shí)，可使mTORC1失活[40]。這表明地榆升白片對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的干預(yù)有可能促進(jìn)白細(xì)胞的修復(fù)與生成。此外，通過參與細(xì)胞對輻射的反應(yīng)(response to radiation)通路，推測地榆升白片能夠間接對放療引起的白細(xì)胞減少癥產(chǎn)生調(diào)治作用。

從通路富集結(jié)果可知，地榆升白片可能主要干預(yù)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂等直接與細(xì)胞生命相關(guān)的通路，亦可通過抗腫瘤方面的作用間接調(diào)控白細(xì)胞減少癥。剪接體參與的前體信使RNA的剪接是所有真核生物從DNA到蛋白質(zhì)的信息交流中必不可少的步驟，而其所包含的多效調(diào)控蛋白1(PLRG1)是細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡的關(guān)鍵核調(diào)節(jié)因子[41]。細(xì)胞周期通路的破壞可導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯，相關(guān)研究表明，此通路與癌癥預(yù)后有關(guān)[42-43]，故推測地榆升白片可通過干預(yù)細(xì)胞周期通路來調(diào)控白細(xì)胞前體細(xì)胞的分裂與再生，同時(shí)具有一定的抗腫瘤作用。核糖體生物發(fā)生的中斷會導(dǎo)致核仁應(yīng)激，激活p53信號傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡[44]。此外，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)超過其折疊能力時(shí)，會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬和與凋亡機(jī)制的串?dāng)_，以影響細(xì)胞存亡[45]。緊密連接(tight junction，TJ)包含細(xì)胞質(zhì)銜接蛋白(ZO蛋白)，與ZO蛋白相關(guān)的ZO-1相關(guān)核苷酸結(jié)合蛋白(ZONAB)可與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、細(xì)胞周期蛋白D1直接相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[46]。河馬信號通路參與細(xì)胞增殖與程序性死亡，其失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞異常生長和腫瘤生成[47]。此外，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，細(xì)胞凋亡程序通常失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的積累[48]，一定程度的積累則產(chǎn)生放、化療的治療需求。

綜上所述，地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥的主要成分可能是槲皮素、地榆皂苷、山柰酚等，涉及到細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、細(xì)胞分裂、細(xì)胞對輻射的反應(yīng)等多個生物學(xué)過程及通路。這為后續(xù)進(jìn)一步探討地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥的機(jī)制以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了依據(jù)。本課題組后續(xù)將設(shè)計(jì)完善相應(yīng)的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建白細(xì)胞減少癥相關(guān)模型，進(jìn)一步分析地榆升白片治療白細(xì)胞減少癥的作用機(jī)制和分子機(jī)制，以驗(yàn)證本研究的分析和結(jié)論。此外，目前對于具體藥物組分含量及比例因素的定量分析仍缺乏系統(tǒng)的研究模型。今后本課題組將持續(xù)跟進(jìn)相關(guān)進(jìn)展并做進(jìn)一步研究。