紅參皂苷在人尿液的排泄實驗研究△

楊秀偉，周琪樂

北京大學 藥學院/天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191

紅參Ginseng Radix et Rhizoma Rubra是五加科多年生草本植物人參PanaxginsengC. A. Mey.的根和根莖經蒸制成的產品，馳名中外。人參根和根莖含有獨特的四環三萜達瑪烷型三萜[1-5]，經蒸制后許多成分發生了化學結構轉化[6-9]，藥性亦發生了改變[9]。本課題組前期研究報道了紅參中人參皂苷的定量分析[10]，本實驗研究人口服紅參后，其中的人參皂苷在人尿液中的排泄。

1 材料

1.1 儀器

島津LCMS-8050超高效液相色譜-質譜聯用儀，包括Nexera X2 UFLC液相系統：LC-30AD二元泵、SIL-30AC自動進樣器、SPD-M30A檢測器、CTO-20AC柱溫箱；8050型三重四級桿定量質譜：配備ESI離子源和LabSolution工作站；Mettler XS105DU十萬分之一電子天平(METTLER TOLEDO，Zurich，Switzerland)；AR4120型萬分之一電子天平[奧豪斯國際貿易(上海)有限公司]；KQ5200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：40 kHz)。

1.2 試藥

紅參(批號：20131201JLRG)水提取物(批號：PG-Y-201606)由長春加一健康食品有限公司提供，主要制備方法[6]：干燥的紅參粗粉(10 kg)用沸水提取3次，每次80 L，提取4 h；合并提取液，減壓濃縮得干膏4.65 kg。

對照品人參皂苷(G)：20(S)-G-Rh1(1)、G-Rd (2)、G-Rk3(3)、G-Rh4(4)、20(S)-G-Rg3(5)、20(R)-G-Rg3(6)，20(S)-原人參三醇(PPT)(7)、20(R)-PPT (8)、G-化合物(C)-K (9)和20(S)-原人參二醇(PPD)(10) 系本課題組從紅參[6]或人參莖葉總皂苷酸水解產物[11]中分離制備，純度經液相色譜-質譜(LC-MS)測定均大于98%。以上10個對照品的化學結構式見圖1。

圖1 10個對照品(以及口服紅參水提取物后在人尿液中監測到的這些化合物)的結構

LC-MS級別乙腈和甲醇(Fisher Scientific Inc.)；色譜純級別乙腈和甲醇(天津西華特種試劑廠)；超純水(18 MΩ/cm)為本實驗室用Milli-Q Advantage A10 (Millipore，Billerica，USA)制水機自制；HPLC級別乙酸銨(Sigma-Aldrich公司)。

2 方法

2.1 色譜與質譜條件

液質分析C18色譜柱為Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；預柱Waters ACQUITY UPLCBEH Shield RP18VanGuardTMPre-Column (5 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流動相為0.1 mmol·L-1醋酸銨水溶液(A)和乙腈(B)，采用梯度洗脫方式，梯度洗脫(0～4 min，72%～67%A；4～6 min，67%～61%A；6～6.1 min，61%～58%A；6.1～13 min，58%～53%A)；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣體積為2 μL。

質譜優化參數：霧化氣流速為3 L·min-1；干燥氣流速為10 L·min-1；加熱氣流速為10 L·min-1；接口加熱器溫度為300 ℃；脫溶劑管溫度為250 ℃；接口電壓：-3.0 kV；檢測器電壓為1.80 kV。電離源為電噴霧離子源，負離子掃描模式，掃描方式為多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)。

選擇監測的10個化合物及內標地高辛(digoxin)的MRM離子對、滯留時間(dwell time)、Q1和Q3能量、碰撞能量(CE)見表1。

表1 測定的10個三萜成分及內標(地高辛)的質譜MRM參數

2.2 儲備液及工作溶液的配制

精密稱取上述10個對照品各適量，分別精密加入LC-MS級甲醇配制成1.0 mg·mL-1的儲備液；精密稱取內標化合物地高辛適量，加入LC-MS級甲醇配制成1.0 μg·mL-1的內標溶液。制備標準溶液時，以甲醇將儲備液稀釋成一系列工作溶液，密封，置4 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 混合對照品溶液的配制

分別移取適量儲備液混合并稀釋制成混合對照品母液。連續稀釋混合對照品母液得到一系列混合對照品線性工作液。

2.4 方法學驗證

分別對分析方法的專屬性、系統適用性、線性、檢測下限和定量下限、重復性、提取回收率和穩定性進行方法學考察，結果表明，該方法能夠用于上述10個分析物的含量測定(數據略)。各待測化合物的內標校正曲線的線性范圍和回歸方程見表2。

2.5 口服紅參提取物

成年人(62 kg體質量，男，55周歲)口服紅參提取物2 g(相當于4.30 g紅參)，然后分別在0～3、3～6、6～12、12～24 h收集尿液，尿液經過濾后，加入甲醇-乙腈(3∶1)沉淀離心后，收集上清液待進一步處理分析。

3 結果與分析

3.1 色譜行為

在選定的色譜條件下，10個人參皂苷類化合物和內標地高辛的保留時間見表1；MRM圖譜顯示無內源性物質對其干擾，口服紅參水提取物后各時間段人尿液樣品對應的10個化合物的MRM圖譜見圖2。

3.2 人尿液中10個人參皂苷類成分含量

人口服紅參水提取物后各時間段尿液中能檢測到的10個化合物的絕對含量見表3。

表2 各待測分析物的內標校正曲線的線性范圍和回歸方程 ng·mL-1

圖2 人口服紅參提取物后各時間段尿液的MRM圖譜

表3 人口服紅參水提取物后各時間段尿液中10個化合物的絕對含量 ng

4 討論

在人口服紅參水提取物后24 h排泄的尿液中能檢測到10個人參三萜類化合物，其化學結構見圖1。化合物2、5、6、9和10為二醇型達瑪烷三萜，化合物1、3、4、7和8為三醇型達瑪烷三萜。表3中的10個分析物中，除G-C-K在紅參水提取物中不存在外，其他9個人參三萜類化合物在紅參水提取物[6，10]中均存在，盡管如此，本研究結果也不能排除它們是某個或某些人參皂苷在人體內的代謝產物，如：已有研究顯示，志愿受試者口服G-Re(200 mg)，在尿液中可檢測到原形化合物G-Re及其代謝產物G-Rg1、G-F1、G-Rh1和PPT[12]，說明G-Re在體內可代謝為G-Rh1，后者經尿液排泄。證明G-C-K肯定是作為人參皂苷的體內代謝產物，在體內代謝產生，經尿液排泄。在體內代謝轉化為G-C-K的紅參中的皂苷，可能包括二醇型達瑪烷三萜G-Ra1、G-Ra2、G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc、G-Rd、西洋參皂苷-R1(quinquenoside-R1，Q-R1)[6，10]以及相關的中間代謝產物，見圖3。因此，G-C-K可能以較高的血藥濃度出現在體循環中。生物活性研究表明，G-C-K能改善腦缺血再灌注損傷，具有抗炎活性，能夠通過抑制腫瘤細胞的增殖、侵入和轉移，促進腫瘤細胞凋亡及提高化療藥物對其敏感性，減輕其對正常細胞的毒副作用等途徑而表現出良好的抗腫瘤作用[13]。這些結果一方面提示，紅參中多樣性化學結構的一些皂苷，在體內可代謝為同一代謝產物G-C-K，使其血藥濃度提高，更好地發揮作用；另一方面提示能代謝為G-C-K的原形紅參皂苷，可能是紅參的質量標志物。G-C-K繼續水解掉C-20的葡萄糖基，可代謝為20(S)-PPD[14]，20(S)-PPD也是生物活性物質[13]。

在紅參三醇型達瑪烷三萜皂苷中，如G-Re、G-Rf、G-Rg1、G-Rg2、G-Rh1、三七皂苷(notoginsenoside)-R1和R2[6，10]等逐級水解掉糖基，代謝為PPT[14]；C-20差向異構化，PPT存在20(S)-PPT和20(R)-PPT平衡形式，它們也是生物活性物質[13，15]。如果G-Re代謝脫去C-20位的葡萄糖基和C-6位糖鏈末端的鼠李糖基轉化為G-Rh1[14]，甚至代謝到PPT，則對細胞沉默調節蛋白1(silent information regulator two homolog 1,SIRT 1)激活作用增強[15]，有利于紅參發揮延緩人衰老的作用。

圖3 紅參中可能轉化為G-C-K的皂苷

本研究結果證明，紅參含有的某些人參皂苷類成分可在體內代謝轉化為生物活性更強的物質，它們是前藥(pro-drug)。