PSMB5蛋白對牛骨骼肌衛星細胞增殖與成肌分化的影響

來裕婷，朱菲菲，王軼敏，郭宏，張林林，李新，郭益文，丁向彬

（天津農學院動物科學與動物醫學學院/天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300384）

0 引言

【研究意義】 肌肉是動物軀體的重要組成部分，骨骼肌大約占體重的40%，骨骼肌在調節動物新陳代謝、機體運動、能量儲存和健康等方面至關重要，是機體功能正常運轉的必要組分。骨骼肌衛星細胞作為肌源性的干細胞，在肌肉發育分化和肌損傷修復中都發揮了重要的作用。泛素-蛋白酶體系統（Ubiquitinroteasome system, UPS）是真核生物降解蛋白的主要途徑。泛素（ubiquitin, Ub）先標記要降解的蛋白質，然后由蛋白酶體識別和降解[1]。泛素蛋白酶體介導的蛋白降解由泛素（Ub）、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme, E1）、泛素結合酶（ubiquitin-conjugating enzyme, E2）、泛素-蛋白連接酶（ubiquitin-protein ligating enzyme，E3）、去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）、26S蛋白酶體及其底物（蛋白質）構成[2-3]。泛素-蛋白酶體對底物的降解過程主要包括泛素化、蛋白酶體降解、去泛素化3個過程。由于底物蛋白在細胞內廣泛存在，泛素化參與調節細胞周期進程、細胞增殖與分化、以及信號傳導等多種生物學過程[4]。在肌肉發育分化過程中，泛素-蛋白酶體系統可能也發揮了重要的調節作用，具體調控機制亟需進行深入研究?！厩叭搜芯窟M展】26S蛋白酶體是降解泛素化底物的一個ATP依賴型蛋白水解復合體，由20S核心蛋白酶體和19S調節顆粒構成[5-7]。19S調節顆?？梢宰R別泛素化的蛋白，20S是泛素-蛋白酶體系統的中樞蛋白水解結構[8-9]。20S是一個圓筒形結構，由α亞基和β亞基構成的4個環層疊組成，內側的2個β環具有蛋白酶催化水解活性[10]，β1、β2和β5為活性亞基，具有特異性肽切割位點，是整個泛素-蛋白酶體通路降解蛋白的關鍵位點[11-12]。其中，蛋白酶體β5亞基（PSMB5）具有糜蛋白酶樣活性[13]。在肌肉中，泛素-蛋白酶體系統與肌原纖維蛋白的降解密切相關[14-15]。有研究表明，過表達PSMB5可增強人骨髓間充質干細胞20S蛋白酶體活性，提高細胞增殖能力[16]。也有研究表明，PSMB5過表達能夠促進人骨髓間充質干細胞向神經元樣細胞分化[17]。還有研究表明免疫蛋白酶體 β5i 亞基可通過升高鈣調神經磷酸酶的蛋白水平和活性，促進 DOCA 鹽誘導的心肌肥厚[18]。沉默 PSMB5基因可降低神經干細胞蛋白酶體活性抑制新生小鼠神經干細胞的增殖分化能力[19]。也有研究表明在心臟肥大的動物模型中，心臟蛋白酶體亞基的蛋白表達水平與心肌肥厚呈正相關，可能是由于蛋白酶體促進了心臟肥大信號通路中相關蛋白的表達[20]?！颈狙芯壳腥朦c】上述研究提示蛋白酶體亞基 PSMB5可能在細胞分化和肌肉發育過程中發揮了重要的調控作用，但PSMB5對牛肌肉發育分化是否具有調控作用還不清楚。【擬解決的關鍵問題】本研究利用牛骨骼肌衛星細胞體外誘導成肌分化模型，模擬牛骨骼肌生長發育過程，通過改變牛骨骼肌衛星細胞中PSMB5基因的表達水平，研究 PSMB5蛋白對牛骨骼肌衛星細胞體外增殖和成肌分化的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞

牛骨骼肌衛星細胞由天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室分離凍存。

1.2 試驗進行時間及地點

試驗于2019年1—9月在天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室完成。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養箱（SANYO）；熒光倒置顯微鏡（Leica）；通用酶標儀（Biotek）電泳儀、轉膜儀、高靈敏化學發光成像分析系統（Bio-Rad）等。

1.4 主要試劑

DMEM；FBS（Fetal Bovine Serum），HS（Horse Serum），Opti-MEM，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；si-RNA和EdU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博公司；RIPA裂解液，電泳液，電轉液，TBS和發光液購自北京索萊寶公司；Protease inhibitor cocktail購自美國SIGMA公司； BCA試劑盒購自北京康為公司；LipofectamineTM3000 Reagent和 proteasome 20S Antibody抗體購自賽默飛公司；MyHC一抗購自DSHB公司；GAPDH一抗，羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；pcDNA3.1購自武漢淼靈生物科技有限公司；RNA快速提取試劑盒購自艾德萊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自 Takara biotechnology Corporation；All-in-OneTMqPCR Mix，購自GeneCopoeia。

2 方法

2.1 牛骨骼肌衛星細胞的復蘇、傳代及誘導分化

牛骨骼肌衛星細胞體外誘導成肌分化模型的建立參考天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室已建立的方法進行[21]。細胞在37 ℃水浴中復蘇，用1 mL完全培養基（含20% FBS的DMEM）中和，室溫，1 000 r/min 離心 10 min，移除上清，加入適量的完全培養基重懸，接種于60 mm的培養皿中。待細胞融合度達到 80%時傳代，用 37 ℃預熱的 PBS清洗細胞兩次，加入 1 mL 0.25%胰酶室溫消化 2 min，加入1 mL完全培養基終止消化，室溫1 000 r/min離心5 min，移除上清，加入適量的完全培養基重懸，接種于細胞培養板中。待細胞匯合度達到80%，加入分化培養基（含2% HS的DMEM）進行體外誘導分化。

2.2 試驗設計及處理

牛骨骼肌衛星細胞分化前后 PSMB5表達量的檢測：將牛骨骼肌衛星細胞傳代后接種于24孔板，在完全培養基中培養24 h，誘導分化培養72 h，利用RNA快速提取試劑盒分別提取增殖期和分化期牛骨骼肌衛星細胞總 RNA，qRT-PCR檢測牛骨骼肌衛星細胞分化前后PSMB5的mRNA表達差異，Western blotting法檢測 PSMB5在牛骨骼肌衛星細胞分化前后蛋白表達水平的差異。

PSMB5的干擾及過表達效果檢測：設計合成PSMB5 小干擾 RNA si-RNA-PSMB5 （si-PSMB5，序列為：AGAGGAGCCAAGAATTGAA）；構建PMSB5的表達載體 pcDNA3.1-PSMB5（pcDNA-PSMB5）。將牛骨骼肌衛星細胞在24孔培養板內進行增殖培養，當細胞融合度達 80%時，按生產商家說明書利用Lipofectamine 3000轉染已構建的si-PSMB5及過表達載體pcDNA-PSMB5，以si-NC及空質粒pCDNA3.1（pcDNA-NC）轉染細胞作為對照。qRT-PCR及Western blotting法檢測轉染處理后48 h的過表達和干擾效果。

PSMB5對牛骨骼肌衛星細胞增殖的影響：轉染后24 h，按 Cell-Light EdU Apollo In Vitro Imaging Kit試劑盒說明書檢測牛骨骼肌衛星細胞增殖期細胞數。

PSMB5對牛骨骼肌衛星細胞成肌分化的影響：光學顯微鏡觀察干擾和過表達 PSMB5后誘導分化 72h牛骨骼肌衛星細胞肌管形成狀態，Western blotting檢測分化標記因子MyHC的蛋白水平表達。

2.3 qRT-PCR檢測PSMB5的基因表達水平

取 5 μL 總 RNA 利用 All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，再采用qRT-PCR檢測PSMB5基因的表達水平。

qRT-PCR 反應體系：10 μmol·L-1上游引物、10 μmol·L-1下游引物、2.0 μL 5 倍稀釋 cDNA、10 μL 2×All-in-OneTMqPCR Mix，RNase-free water 將體系補至20 μL。qRT-PCR反應引物信息如表1所示。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 The primer information of qRT-PCR

2.4 Western blotting檢測 PSMB5和牛骨骼肌衛星細胞分化標記基因蛋白表達水平

用蛋白裂解液裂解6孔板中增殖期細胞或分化期肌管細胞，收集蛋白，用 BCA法測定蛋白濃度，再通過 Western blotting檢測 PSMB5和分化標志基因MyHC的蛋白的表達量，具體步驟參考本實驗室已建立的方法進行[22]。

圖1 牛骨骼肌衛星細胞分化前后PSMB5表達量的檢測Fig. 1 Expression of PSMB5 in proliferation and differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells

2.5 EdU法檢測牛骨骼肌衛星細胞增殖狀態

將牛骨骼肌衛星細胞接種在 96孔板中，轉染后24 h，按 Cell-Light EdU Apollo In Vitro Imaging Kit試劑盒說明書檢測各處理細胞的增殖期細胞數。每組試驗均設置3個生物學重復，每個生物學重復至少采集3個技術重復或視野。EdU增殖效率=EdU陽性細胞數/Hoechst 33342標記細胞數，分別記數3個200×視野的細胞總數及EdU陽性細胞數。

2.6 統計分析

每組試驗均設置3個生物學重復，所有數據均以“平均數±標準差”表示。EdU結果采用χ2檢驗進行分析；qRT-PCR結果按 2-ΔΔCt法計算，采用t檢驗進行差異顯著性分析，以GAPDH基因作為內參基因對檢測的目的基因進行歸一化?！?”表示差異顯著（P＜0.05），“**”表示差異極顯著（P＜0.01）。

3 結果

3.1 牛骨骼肌衛星細胞分化前后PSMB5表達量的檢測

將牛骨骼肌衛星細胞傳代后接種于24孔板，在增殖培養基中培養24 h，誘導分化培養72 h，qRT-PCR和 Western blotting檢測牛骨骼肌衛星細胞分化前后 PSMB5的表達差異，（圖1）?？芍?，PSMB5在牛骨骼肌衛星細胞分化前后表達水平存在顯著差異，誘導分化后牛骨骼肌衛星細胞中PSMB5的mRNA和蛋白表達量均顯著高于增殖期（P＜0.05）。結果提示 PSMB5可能對牛骨骼肌衛星細胞的成肌分化有一定的調控作用。

3.2 PSMB5干擾及過表達效果檢測

當24孔培養板內增殖期細胞融合度達80%時，轉染小干擾 RNA si-PSMB5和 PSMB5過表達質粒pcDNA-PSMB5，轉染處理后 48 h后，qRT-PCR及Western blotting檢測細胞中PSMB5的表達水平變化。結果如圖2和圖3所示，轉染si-PSMB5后，PMSB5的mRNA表達水平（圖2-A）及蛋白表達水平（圖2-B）顯著低于對照組（P＜0.05）；轉染 pcDNA-PSMB5過表達質粒后，PSMB5的mRNA水平（圖3-A）及蛋白表達水平（圖3-B）顯著高于對照組（P＜0.01）。結果表明小干擾RNA以及構建的PSMB5過表達質粒分別對牛骨骼肌衛星細胞具有明確的干擾和過表達效果。

圖2 siRNA的干擾效果檢測Fig. 2 Detection of interference effects of si-PSMB5

3.3 PSMB5對牛骨骼肌衛星細胞增殖的影響

將 96孔板中細胞轉染 si-PSMB5和 pcDNASMB5，轉染處理24 h后，采用EdU法檢測牛骨骼肌衛星細胞的增殖狀態。結果如圖4所示，干擾或過表達PSMB5后，牛骨骼肌衛星細胞EdU陽性細胞率與對照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。結果表明PSMB5對牛骨骼肌衛星細胞的增殖沒有明顯的影響。

圖3 PSMB5質粒載體的過表達效果檢測Fig. 3 Detection of pcDNA-PSMB5 overexpression effect

圖4 EdU法檢測干擾及過表達PSMB5對牛骨骼肌衛星細胞增殖的影響Fig. 4 EdU detects proliferating cells of bovine skeletal muscle satellite cells after knockdown and overexpression of PSMB5

3.4 PSMB5對牛骨骼肌衛星細胞成肌分化的影響

干擾或過表達PSMB5后，將牛骨骼肌衛星細胞誘導分化 72 h，然后采用光學顯微鏡觀察牛骨骼肌衛星細胞肌管形成狀態，Western blotting 檢測分化72 h后PSMB5以及分化標記因子MyHC的蛋白水平表達。如圖5所示，干擾PSMB5后，從細胞形態圖來看，試驗組形成的肌管數量明顯少于對照組（圖5-A）；Western blotting檢測結果顯示，干擾PSMB5表達后，分化標志因子MyHC的蛋白水平顯著降低（P＜0.01）（圖5-C）；誘導分化72 h時，PSMB5蛋白水平仍顯著低于對照組（P＜0.01）（圖5-D）。過表達PSMB5后，試驗組中形成的肌管數量明顯多于對照組（圖5-B）；Western blotting檢測結果顯示，過表達PSMB5后，分化標志因子MyHC的蛋白表達水平顯著高于對照組（P＜0.01）（圖5-E）；誘導分化72 h，試驗組PSMB5的蛋白表達水平仍高于對照組但差異不顯著（P＞0.05）（圖5-F）。研究結果表明干擾 PSMB5的表達會抑制牛骨骼肌衛星細胞體外成肌分化進程，而過表達 PSMB5可以促進牛骨骼肌衛星細胞體外成肌分化進程，PSMB5對牛骨骼肌衛星細胞的成肌分化過程具有顯著的調控作用。

4 討論

骨骼肌發育過程極其復雜,主要包括體節細胞增殖分化、成肌細胞增殖分化、肌管成熟以及肌纖維形成等環節。骨骼肌衛星細胞是骨骼肌中具有分化增殖潛能的肌源性干細胞，通常以靜息狀態存在于肌纖維肌膜與基底膜之間，在一定的條件下可以被激活，發生增殖和分化。衛星細胞在動物出生后肌肉的生長發育和再生過程中發揮著十分重要的作用[23-24]。肌衛星細胞的體外成肌分化過程很好地模擬了體內的發育過程，成為研究細胞分化和肌肉發育發生機制的良好細胞模型。泛素-蛋白酶體途徑在細胞內普遍存在，從細胞膜、細胞質到細胞核等處的蛋白質都受到泛素化酶和蛋白酶體的監控[25]。有研究表明，對于處于活躍增殖期的細胞如血管平滑肌，泛素-蛋白酶體主要通過NF-κB抑制細胞凋亡，引起血管平滑肌細胞發生增殖性病變；對于已經分化并且處于非分裂期的細胞，如在不穩定的動脈粥樣硬化斑塊中的細胞，泛素-蛋白酶體抑制細胞凋亡的作用明顯減弱[26]。此外，蛋白酶體可以降解凋亡相關蛋白，抑制蛋白酶體活性，可以促使 p53、凋亡蛋白Bax和蛋白激酶C（PKC）等集聚，進而促使心肌細胞凋亡[27]。在小鼠骨骼肌衛星細胞的再生過程中，蛋白酶體的活性上升[28]。另外，泛素-蛋白酶體系統在肌肉萎縮和神經損傷變性過程中都發揮了重要作用。應用蛋白酶體抑制劑MG-132能抑制離體神經肌細胞蛋白降解，延緩離體神經軸突變性的發生[29]。綜合以上研究發現，泛素-蛋白酶體系統在細胞增殖、分化中起著非常重要的作用。PSMB5為蛋白酶體中具有水解活性的亞基，在泛素-蛋白酶體中發揮著重要作用，它可能在細胞分化和肌肉發育過程中發揮了重要的調控作用。目前，PSMB5在牛骨骼肌衛星細胞增殖分化中的表達模式和調控作用還不清楚，因此，筆者檢測了牛肌衛星細胞增殖分化過程中PSMB5的mRNA和蛋白表達水平的變化,檢測結果發現 PSMB5在牛骨骼肌衛星細胞分化前后表達水平存在顯著差異，PSMB5在牛骨骼肌衛星細胞分化期的表達水平較高，推測其對牛骨骼肌衛星細胞的增殖和分化過程可能具有一定的影響。

圖5 干擾和過表達PSMB5對牛骨骼肌衛星細胞分化的影響Fig. 5 Effects of interference and overexpression of PSMB5 on the differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells

有研究報道，選擇性敲除小鼠肌衛星細胞特異性19S蛋白酶體調節亞基（Rpt3）基因，會阻礙小鼠體內肌再生過程，同時還會抑制肌再生過程中肌衛星細胞的增殖與分化[30]。PSMB5基因沉默可降低神經干細胞蛋白酶體活性抑制小鼠神經干細胞的增殖分化能力[19]。PSMB5過表達能夠促進人骨髓間充質干細胞向神經元樣細胞分化[17]。在本研究中，通過模擬體內肌衛星細胞增殖分化過程，成功建立體外牛肌衛星細胞增殖分化模型，設計si-RNA抑制PSMB5的表達，干擾PSMB5后發現，細胞分化能力減弱，肌管數量明顯減少，同時牛骨骼肌衛星細胞分化標志基因 MyHC的蛋白表達量下調，試驗結果表明，干擾 PSMB5表達會抑制牛肌衛星細胞的分化；構建 PSMB5過表達載體，轉染細胞后發現，過表達 PSMB5的牛骨骼肌衛星細胞分化能力增強，肌管數量增多，且MyHC蛋白表達量上調，說明過表達 PSMB5后能夠促進牛骨骼肌衛星細胞的成肌分化。本研究結果表明，PSMB5對牛骨骼肌衛星細胞的成肌分化過程具有顯著的調控作用，與骨髓間充質干細胞和小鼠神經干細胞上研究類似，PSMB5在牛骨骼肌衛星細胞上表現出了對細胞分化的調控作用，但 PSMB5在牛骨骼肌衛星細胞上沒有表現出在骨髓間充質干細胞和神經干細胞上類似的對增殖的調控作用，可能是其在不同細胞類型中發揮作用的途徑不一致，具體的調控作用機制還有待進一步研究。

5 結論

本研究發現PSMB5蛋白對牛骨骼肌衛星細胞的成肌分化過程具有顯著的調控作用。干擾PSMB5表達可以抑制牛骨骼肌衛星細胞的成肌分化進程，而過表達 PSMB5可以促進牛骨骼肌衛星細胞體外成肌分化進程。研究探明了PSMB5蛋白對牛骨骼肌衛星細胞增殖和成肌分化的具體調控作用，為進一步開展 PSMB5在牛成肌分化中的調控機制研究奠定了基礎。