耐草甘膦轉EPSPS/GAT大豆多重PCR檢測體系的建立及應用

文靜，郭勇，邱麗娟

（1東北農業大學農學院，哈爾濱150030；2中國農業科學院作物科學研究所/國家農作物基因資源與遺傳改良重大科學工程/農業部作物種質資源與生物技術重點開放實驗室，北京100081）

0 引言

【研究意義】自1994年第一個商業化的轉基因植物（FlavrSavr tomato）被批準上市以來，植物基因工程技術在現代農業中得到了廣泛的應用[1]。目前已有24個國家/地區種植了轉基因作物，42個國家/地區進口轉基因作物用于糧食、飼料和加工。全球轉基因作物的種植面積從1996年的170萬hm2增加到2018年的1.917億hm2，增長了113倍，而轉基因大豆作為種植面積最大的轉基因作物，種植面積達到全球轉基因作物種植面積的 50%[2]。隨著轉基因作物產業化和商業化程度的不斷擴大，全球對轉基因食品安全、環境風險和倫理問題的爭議加劇[3]，越來越多的國家和地區要求對轉基因食品和成分進行標識[4]。部分國家要求轉基因生物（genetically modified organism，GMO）含量需要低于一定閾值水平的限制。例如，歐盟將非轉基因背景下的轉基因物質的閾值設定為0.9%[5]。因此，標準化的轉基因成分檢測和鑒定方法是轉基因發展和商業化的關鍵步驟，也在轉基因生物的安全評估和風險管理中發揮了重要作用[6]。現有的轉基因檢測方法大多基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），并由于其具有通用性、敏感性、特異性和高通量的特點，可用于復雜轉基因成分分析，包括篩查外源調控元件和目的基因，并對特定的轉基因成分進行鑒定[7]。多重PCR技術是在同一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，實現對多個靶標的擴增，更能節省轉基因生物檢測中時間和成本[8-9]。【前人研究進展】呂山花等[10]應用PCR檢測方法，以大豆凝集素（lectin）基因為內參，檢測了4個抗草甘膦轉基因大豆品種及草甘膦敏感大豆品種豫豆12的外源CaMV35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS成分。目前，中國允許進口的轉基因大豆有 16種（具體包括 A2704-12、CV127、MON87701、MON87769、GTS40-3-2、MON87708、305423、A5547-127、FG72、MON89788、SYHT0H2、MON87701×MON89788、DAS-44406-6、305423×GTS40-3-2、MON87705 和 356043，其中 MON87701×MON89788和305423×GTS40-3-2為復合性狀轉基因大豆），農業部針對這些轉基因大豆品系發布的檢測方法以核酸檢測為主，但是其方法均為單重 PCR檢測。針對轉基因大豆建立系統的、高通量的由“公共引物”介導的多重PCR轉基因大豆檢測體系，可大幅降低檢測成本、提高檢測效率，為轉基因安全評價提供新的檢測技術和方法[11]。多重PCR檢測體系并不是多個單重 PCR體系檢測體系的簡單疊加，它需要對PCR體系和程序進行反復試驗、優化和驗證，保證多重PCR具有足夠的特異性、靈敏性和適用性，最終實現多個目標片段的同時擴增，因此，與普通PCR相比，難度更大[12]。近年來，國內外有諸多學者對其進行研究，并建立了許多關于通用元件、基因特異性和轉化事件特異性的多重PCR檢測體系[8,13-16]。尹全等[17]以抗草甘膦大豆GTS40-3-2的通用元件作為檢測參數，建立了大豆內源基因lectin、CaMV35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS的四重PCR檢測體系。AO等[18]根據外源基因的特異性建立了適用于轉基因大豆、玉米、水稻中CP4-EPSPS、Cry1A(b)、BAR、PAT檢測的多重PCR方法。KIM等[19]針對RRS、GTS40-3-2、A2704-12、DP356043-5、MON89788、A5547-127 和DP305423-1 6個商業化轉基因大豆特異性事件，建立了包含內參基因的七重PCR檢測體系。付偉等[20]以轉基因大豆 DAS44406-6品系為研究對象，利用Multiplex PCR技術與其他技術相結合，建立了多重實時熒光PCR檢測體系，檢測靈敏度為0.01%。【本研究切入點】目前，大多數轉基因大豆的多重PCR技術都是針對通用元件和基因特異性進行檢測，或者針對多個商業化特異性轉化事件進行篩選，而單一轉化事件特異性鑒定鮮見報道[21]。在轉基因生物檢測中，轉化事件特異性檢測的目標片段是外源基因和宿主DNA之間的連接區域，故比單純基因特異性檢測和通用元件檢測具有更高的特異性[22-23]。【擬解決的關鍵問題】本研究基于轉基因成分檢測技術及要求，以轉基因大豆 ZH10-6為研究對象，針對內參基因、外源基因和側翼序列設計 5對特異性引物，構建了轉EPSPS/GAT大豆ZH10-6多重PCR反應體系，并用本研究建立的多重 PCR檢測體系檢測了ZH10-6的 11個衍生品系，為中國抗草甘膦轉基因大豆新品種目標基因鑒定提供信息和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉基因大豆ZH10-6、受體中黃10及11個ZH10-6衍生品系均為中國農業科學院作物科學研究所大豆基因資源挖掘與利用實驗室保存樣品。

1.2 樣品基因組DNA的提取

參照植物基因組提取試劑盒說明書提取樣品DNA，用紫外分光光度計測量DNA樣品質量及濃度，并用1×TE緩沖液將DNA 稀釋至50 ng·μL-1。

1.3 引物的設計及篩選

使用軟件 Primer Premier 5.0 進行引物設計，設計時遵從多重PCR檢測引物設計與篩選的原則，根據抗草甘膦大豆 ZH10-6和受體中黃 10的分子特征，設計大豆內源參考基因（Actin）、外源基因（G2-EPSPS和GAT）以及側翼序列（G2EPSPS-2/ZH10P2和ZH10P1/GAT-2）的特異性引物（表1）。將各個檢測基因的上、下游引物使用滅菌的超純水稀釋為10 μmol·L-1。

表1 多重PCR標記及其相關信息Table 1 The markers for multiplex PCR and their related information

1.4 引物特異性和適用性檢測

單重 PCR 反應體系為 25 μL，包括 DNA 2 μL（50 ng·μL-1）、Ex Taq 酶 0.2 μL、10×ExTaq Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物（10 μmol·L-1）0.6 μL 和ddH2O 17.7 μL。

多重 PCR 反應體系為 25 μL，包括 DNA 2 μL（50 ng·μL-1）、Ex Taq 酶 0.2 μL、10×ExTaq Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物（10 μmol·L-1，GmActin11 F/R 0.6 μL、G2-EPSPS F/R 0.6 μL、GAT F/R 0.6 μL、ZH10P1/GAT 0.6 μL、G2/ZH10P2 0.6 μL）和 ddH2O 15.3 μL。

單重和多重 PCR 反應程序為 95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72 ℃ 1 min20 s 35個循環；72℃ 8 min；4℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR產物，并利用凝膠成像系統觀察。

1.5 多重PCR反應體系和程序的優化

以轉基因大豆ZH10-6和受體中黃10的DNA為模板，將 5對引物的用量設置為 GmActin11 F/R 0.4 μL、G2-EPSPS F/R 0.6 μL、GAT F/R 0.4 μL、ZH10P1/GAT 0.6 μL 和 G2/ZH10P2 0.6 μL，DNA 模板量設置為100、150、200和250 ng 4個梯度，退火溫度設置為55℃、58℃和60℃，延伸溫度設置為 68℃和 72℃ 2 個梯度，dNTP 含量為 2、3、4 和 5 μL 4 個梯度，分別進行多重PCR擴增，篩選出五重PCR體系的最優反應條件。

1.6 多重PCR靈敏度檢測

為了驗證多重PCR體系靈敏性，將相同濃度的轉基因大豆ZH10-6和受體中黃10的基因組DNA按質量比混合，制備成100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%和0的DNA樣品。使用1.5建立的多重PCR體系及程序進行多重PCR方法靈敏度檢測。

1.7 多重PCR體系的應用

用建立的多重PCR體系對轉基因大豆ZH10-6衍生品系進行檢測，包括東北地區和黃淮地區材料，進一步驗證多重PCR體系的實用性。

2 結果

2.1 樣品 DNA 檢測

使用NanoDrop 2000/2000c超微量分光光度計測定樣品DNA濃度和質量，經測定，樣品OD260/OD230比值均為 2.0—2.2，OD260/OD280比值均為 1.8—2.0，說明提取的樣品DNA質量較好。用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品進行檢測，僅1號樣品第三條帶有降解，該樣品不在后續試驗中使用，其余樣品幾乎無降解，符合多重PCR試驗要求（圖1）。將樣品DNA濃度稀釋至 50 ng·μL-1，備用。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳DNA檢測結果Fig. 1 DNA detection results of 1% agarose gel electrophoresis

2.2 引物特異性和適用性檢測

以轉基因大豆ZH10-6和受體中黃10的DNA為模板進行5對引物特異性和適用性檢測。單引物擴增時，5對引物均可在目的位置處觀察到特異性條帶，未觀察到明顯的非特異性條帶。5對引物同時擴增時，轉基因大豆 ZH10-6可以擴增出多條特異性條帶，但個別條帶相對微弱（圖2），表明這5對引物可以用于多重PCR區別ZH10-6和受體中黃10，但是需要進一步調整擴增條件。

2.3 多重PCR檢測體系的建立

多重PCR體系中，將5對引物用量均設置為0.6 μL時，部分條帶不能被擴增（圖2）。可以看出在多重PCR中，引物存在強弱之分，需要減少相對較強引物GmActin11 F/R和GAT F/R的用量。以條帶亮度作為參考，最終將5對引物的用量設置為GmActin11 F/R 0.4 μL、G2-EPSPS F/R 0.6 μL、GAT F/R 0.4 μL、ZH10P1/GAT 0.6 μL 和 G2/ZH10P2 0.6 μL。將 DNA模板量、退火溫度、延伸溫度和dNTP含量均設置為不同梯度，進行同時擴增（圖3），篩選多重PCR最適溫度和體系。

通過不同體系檢測（圖4），多重PCR擴增最適體系為：DNA 2—4 μL、Ex Taq 0.2 μL、10×ExTaq Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物（GmActin11 F/R 0.4 μL、G2-EPSPS F/R 0.6 μL、GAT F/R 0.4 μL、ZH10P1/GAT 0.6 μL 和 G2/ZH10P2 0.6 μL），ddH2O補足 25 μL。多重 PCR 擴增最適程序為 95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，68 ℃ 1 min20 s ，35個循環；72 ℃ 1 2 min；4℃保存。最終擴增產物長度為內參基因 126 bp、外源基因G2-EPSPS430 bp、外源基因GAT338 bp、側翼序列 ZH10P1/GAT-2 810 bp、側翼序列 G2EPSPS-2/ZH10P2 1 626 bp。其中，受體中黃10除了可以擴增出Actin內參序列以外，還可以擴增出ZH10-6 2對側翼序列的上游引物ZH10P1和下游引物ZH10P2的632 bp片段，而在ZH10-6中，由于插入外源基因過大，此段序列無法被擴增出。因此，受體中黃 10可以被擴增出 2條帶，而轉基因材料ZH10-6可以被擴增出 5條帶，此體系可以用于鑒定ZH10-6和受體中黃10。

2.4 多重PCR體系靈敏度檢測

將模板DNA稀釋至設定濃度，通過多重PCR靈敏度試驗（圖5），隨著受體中黃10質量分數的上升，特異性片段632 bp的條帶逐漸變亮，而ZH10-6的5條帶則出現不同程度的減弱，特別是外源基因G2-EPSPS的 430 bp條帶和側翼序列 G2EPSPS-2/ZH10P2為1 626 bp條帶。因為在轉基因大豆ZH10-6和非轉基因大豆中黃 10混合后，相對于原有的多重PCR體系中增添了一重PCR反應。靈敏度是非轉基因樣品中轉基因成分的最低檢測限，雖然圖5轉外源基因G2-EPSPS的430 bp條帶和側翼序列G2EPSPS-2/ZH10P2為1 626 bp條帶相比于其他條帶較弱，但是仍可以看出條帶所在位置。因此，只要樣品中含有0.5%以上的ZH10-6轉基因成分，利用此體系都能檢測出目標條帶。說明建立的多重 PCR體系靈敏度可達0.5%，符合歐盟有關轉基因產品標識的要求。

2.5 多重PCR體系的應用

以轉基因大豆ZH10-6衍生品系的DNA為模板，將 DNA 濃度稀釋成 50 ng·μL-1。用建立的多重 PCR體系待測大豆進行多重擴增，根據不同的條帶類型，判斷ZH10-6衍生品系中外源基因和側翼序列情況（圖6）。主要檢測到5種帶型（表2），類型1出現與受體中黃10相同帶型，認為是未發生雜交的野生型；類型2出現與ZH10-6相同帶型；類型3和類型4分別以NZC400和NZK001為例，認為是其他轉化事件；第5類帶型包含ZH10-6和受體ZH10的全部6條帶型，認為是轉基因雜合材料。在11份ZH10-6衍生品系中，NZC100和NZC400為黃淮材料，剩余為東北材料。用單重PCR對該擴增結果進行驗證，與多重PCR鑒定結果完全一致，證明建立的多重PCR體系可以鑒定轉基因大豆ZH10-6和受體中黃10，也可以鑒定不同地區的ZH10-6衍生品系，應用性較為廣泛。

圖2 單基因特異性檢測結果Fig. 2 Single gene specific test results

表2 ZH10-6衍生品系類型Table 2 The derived lines of ZH10-6

圖3 梯度多重PCR檢測結果Fig. 3 Results of gradient multiple PCR

圖4 單重及多重PCR檢測ZH10-6及中黃10Fig. 4 Single and multiple PCR detection of ZH10-6 and ZH10

圖5 多重PCR靈敏度檢測Fig. 5 Results of multiple PCR sensitivity detection

圖6 ZH10-6衍生品系檢測Fig.6 Test results of ZH10-6 derivative lines

3 討論

PCR檢測技術是轉基因作物及產品中外源基因檢測的重要手段[24-25]，相比于普通PCR，多重PCR只需一個反應和一次電泳就可同時檢出多個目標片段，可極大地節約試劑和時間[26-27]，目前，已被廣泛應用到醫學及生物等領域[28]。在研究過程中發現，不同引物序列的多重PCR在實際應用中會受各項參數直接影響。

3.1 多重PCR體系中引物選擇的直接依據

本研究中選擇特異性強、引物二聚體少的5對引物進行擴增，其中包括起質量控制作用的內源基因，以避免轉基因檢測的假陰性結果出現。多重PCR擴增時，各個引物的擴增并非均一的，本研究通過5對引物等量加入時的條帶亮度對引物進行強弱判斷，選擇各基因擴增效率相對一致的引物濃度配比條件建立了多重PCR體系。引物設計是多重PCR反應成敗的關鍵，需要遵循PCR引物設計通用準則，即單條引物長度一般為18—25個堿基，且4種堿基的比例要適當，G+C含量一般為40%—60%。同時，選擇的引物必須高度特異，彼此之間無同源性，且連續互補的堿基不超過 4個，避免出現交叉錯配等現象[29]。引物之間TM值盡可能相差較小，可以實現在同一退火溫度下的擴增。

3.2 不同反應體系和條件對多重 PCR體系建立的影響

在建立多重PCR反應體系時，反應體系和條件是關鍵因素[30-31]。反應體系主要包括DNA模板量、dNTP含量等。本研究將DNA模板量從100 ng增加至250 ng時，擴增效果沒有明顯變化，說明 DNA模板量對多重PCR體系擴增影響較小。同時發現在多重PCR擴增中，dNTP含量可以同單重 PCR擴增設置一致，dNTP含量過高反而會抑制反應。

反應條件是另一個關鍵因素，主要包括退火溫度和延伸溫度。一般情況下，可以依據引物的TM值減少 5℃直接選擇退火溫度，但有時結果與預期并不一致。較為簡單的方法就是設置54℃為初始退火溫度，如果多重PCR擴增產生非特異性條帶，需適當提高引物退火溫度，反之則降低引物退火溫度[32]。退火溫度應在Tm值允許范圍內選擇較高的溫度，以確保PCR反應的特異性。但在這個過程中會出現目標片段擴增變弱的現象，可以通過延長延伸時間來消除。同時適當降低延伸溫度有利于目標條帶的產生。本研究中設置了55℃、58℃和60℃ 3個退火溫度，68℃和72℃2個延伸溫度，最終在退火溫度為60℃，延伸溫度為68℃時，多重PCR體系擴增效果最好。

3.3 目標片段的選擇對多重PCR體系靈敏度的影響

在多重PCR目標片段的選擇時，目標片段必須具有高度特異性,避免目標片段之間的競爭性擴增，才能實現高效靈敏的擴增反應，建議PCR產物片段大小在200 bp以內時，片段間隔大于30 bp；產物在500 bp以上時，片段間隔要大于 70 bp[33]。此外，各個目的片段長度應差異明顯，以便于鑒別，但最大和最小片段最好相差不超過400 bp，否則會導致多重PCR體系靈敏度降低，且體系建立的難度較大。目前轉基因大豆多重PCR技術中，董立明等[34]選擇商品化早、種植面積大的5種轉基因大豆品系305423、MON89788、CV127、GTS40-3-2、356043及大豆內源基因Lectin為研究對象，選用相應的國家標準和文獻中的引物，建立了能同時檢測5種轉基因大豆品系和大豆內源基因的六重PCR檢測體系，檢測最大片段和最小片段相差400 bp，該體系能夠從0.1%及以上含量的陽性對照樣品中檢測出全部6種靶標成分。本研究檢測的目標片段是外源基因和宿主 DNA之間的連接區域，具有更高的特異性，擴增最大目標片段與最小片段之間高達1 500 bp，但靈敏度也能達到0.5%，完全符合歐盟有關轉基因標識的要求。同時，該多重 PCR體系在ZH10-6和受體中黃10混合體系中，實現了六重PCR擴增。

4 結論

通過設計內參基因、外源基因和側翼序列引物并對反應體系和條件進行優化，建立的轉EPSPS/GAT大豆多重PCR檢測體系具有高通量、特異性強、操作簡便和應用廣泛的優點，并且能夠快速、準確地檢測轉基因大豆ZH10-6及其衍生品系。