響應面法優化低溫水提薏苡仁糖蛋白的制備及理化特性的研究*

鄭文宇，林維杰，楊容，楊土娣，李靜，廖蘭,

（1.佛山科學技術學院 食品科學與工程學院，廣東 佛山 300134；2.福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州 350102）

薏苡仁具有抗腫瘤、提高機體免疫、抗菌、抗炎、鎮痛、降血糖和調血脂等藥理活性作用[1]。李時珍在《本草綱目》稱其為上品養心藥。薏苡仁含淀粉60%～65%、多糖5.28%、蛋白質18.31%、脂肪5.61%[2]，還含豐富的B族維生素和磷、鐵、鈣、鋅、鉀等多種礦物質。薏苡仁結構緊密，淀粉含量高，水溶性較差，生物活性物質提取率較低且易產生回生、老化和沉淀的現象，導致其難以消化，一定程度限制了其開發利用。

目前，國內外學者已就薏苡仁酯、多糖、脂類等的化學成分和功能作用進行了深入研究[3]，但對其蛋白類活性物質的研究有限，特別是其糖蛋白組分的研究缺乏。張怡等[4]通過石油醚脫脂和水提乙醇、丙酮、乙醚沉法制備糖蛋白粗品，杜曉旭[5]通過熱水浸提和Sevag法制備薏苡仁糖蛋白粗品。由于缺乏高純度樣品，目前薏苡仁糖蛋白的研究局限于提升薏苡仁糖蛋白得率的手段、分離純化方式等方面，缺乏深入薏苡仁糖蛋白高純度活性構效關系的研究。本文以響應面法優化低溫水提法的制備較高純度的薏苡仁糖蛋白，并對其理化特性進行研究，為后續O-糖鏈釋放前后對于薏苡仁糖蛋白活性構效關系的研究提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

薏苡仁，白殼種，購自福建南平浦城集貿市場；

三氯甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、菲咯嗪，國藥集團化學試劑有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

電子天平（ML204）：梅特勒-托利儀器有限公司；

高速組織勻漿機（PT 2100）：寶創科技股份有限公司；

高速冷凍離心機（TGL-20MB）：長沙湘智離心機有限公司；

高速分散均質機（FM200）：廈門精藝業主科技有限公司；

實驗室pH計（EL20 ）：梅特勒-托利多儀器有限公司；

傅里葉紅外光譜儀（Nicolet）：美國尼高力儀器公司 ；

酶標儀（Spark-10M）：帝肯上海貿易有限公司；

冷凍干燥機（FD-1C-50）：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 預處理

將薏苡仁打粉過80目篩，配制成20%（質量分數）懸浮液，30 ℃恒溫水化12 h。高壓均質20 MPa、3次，冷凍干燥制樣，密封陰涼干燥處儲存備用。

1.2.2 薏苡仁糖蛋白提取精制工藝流程

薏苡仁凍干粉→水提法（控制料液比、時間、溫度）→離心→過濾→蒸發濃縮→Sevag法脫除游離蛋白質→無水乙醇沉淀→溶解、透析→真空冷凍干燥→薏苡仁糖蛋白精制品（CSGP）

⑴ Sevage法脫除游離蛋白：薏苡仁糖蛋白濃縮液加入Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=3∶1[體積分數]），其中薏苡仁糖蛋白濃縮液與Sevage試劑比例為4∶1（體積分數），磁力攪拌40 min，脫除游離蛋白質，離心取上清液，重復上述操作4～5次。

⑵ 醇沉：取上清液以1∶4（體積分數）的比例加入95%乙醇，磁力攪拌35 min，密封包裝置于4 ℃冰箱中放置12 h，10,000 r/min離心30 min，收集沉淀為薏苡仁糖蛋白粗品。

⑶ 透析：將薏苡仁糖蛋白粗品溶于水中，裝入截留分子量為8,000～14,000 Da的透析袋內，流動的自來水透析處理48 h，收集透析袋內的液體，冷凍干燥得薏苡仁糖蛋白精制品（CSGP）。

1.2.3 薏苡仁糖蛋白含量的測定

采用王應強[6]的苯酚-硫酸法方法稍作修改，具體方法如下：

⑴ 標準葡萄糖溶液配制：準確稱取10 mg的葡萄糖標準品，加水定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液。

⑵ 標準曲線繪制：準備6支帶塞試管，移入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準葡萄糖溶液。加入水補足至1.0 mL，移取1.0 mL苯酚溶液，立即移入濃硫酸5.0 mL。靜置20 min，使苯酚和硫酸充分反應，振蕩均勻，混合。放置于30 ℃的水浴中，恒溫反應20 min。建立對照，確定490 nm處吸光度，平行測定3次，取平均值。以葡萄糖濃度和吸光度為水平坐標和垂直坐標，繪制標準曲線，建立線性回歸方程。

⑷ 換算因子f的確定：根據陳雙[7]的方法稍作修改，準確稱量薏苡仁糖蛋白粗品10 mg，用蒸餾水定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的溶液，搖勻后靜置存放。準確吸取1 mL 0.1 g/L的薏苡仁糖蛋白粗品溶液，按本章2.3.2.1的處理步驟進行操作，測出吸光值A，代入回歸方程A=12.9C+0.0037，R2=0.9996中，計算出薏苡仁糖蛋白粗品中葡萄糖的濃度和理論薏苡仁糖蛋白質量M（mg），重復3次操作，測定3次結果，取平均值記為M=0.05169 mg；記實際薏苡仁糖蛋白質量m0（mg），換算因子計算結果為f=m0/M=1.93471；薏苡仁糖蛋白含量的計算公式為C=(A-0.0037)×n×f/12.9，其中A為樣品的吸光值，C為樣品濃度（mg/mL），n為稀釋倍數，f為換算因子。

1.3 單因素實驗

1.3.1 料液比對薏苡仁糖蛋白得率的影響

取6個25 mL錐形瓶，稱量樣品0.5 g/個，將裝有配制好的樣品用保鮮膜塑封瓶口防止濺出，在恒溫水浴振蕩器中水化提取，按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，溫度35 ℃，反應時間3 h，進行不同料液比下的單因素實驗，設置3次平行實驗。

1.3.2 溫度對酶解產物抗氧化活性的影響

取6個25 mL錐形瓶，稱取樣品0.5 g/個，將裝有配制好的樣品用保鮮膜塑封瓶口防止濺出，在恒溫水浴振蕩器中水化提取，按每小時取一次樣，溫度35 ℃，料液比1∶10，進行不同提取時間的單因素實驗，設置3次平行實驗。

1.3.3 提取溫度對薏苡仁糖蛋白得率的影響

取6個25 mL錐形瓶，稱取樣品0.5 g/個，將裝有配制好的樣品用保鮮膜塑封瓶口防止濺出，在恒溫水浴振蕩器中水化提取，按20～45 ℃每5 ℃，料液比1∶10，反應時間3 h，進行不同溫度下的單因素實驗，設置3次平行實驗。

1.4 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken 設計原理，以薏苡仁糖蛋白得率（Y）為響應指標，選取提取時間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）為響應因子，進行3因素3水平響應面實驗設計，確定抗氧化肽制備的最佳工藝條件。實驗因素水平表見表1。

表1 響應面實驗因素水平編碼表

1.5 薏苡仁糖蛋白（CSGP）O-糖鏈釋放產物（DCSGP）的制備

根據Zheng等[7]人的方法稍作修改，取1.0 mg CSGP溶解于10 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液中，反應在55 ℃進行6 h，使O-糖鏈釋放（發生β-消除反應），得到產物記為DCSGP。

1.6 薏苡仁糖蛋白O-糖鏈釋放前后的理化性質測定

1.6.1 CSGP、DCSGP蛋白質含量和糖含量測定

根據杜曉旭等[8]人的方法稍作修改：采用凱氏定氮法和苯酚-硫酸法。

1.6.2 CSGP、DCSGP定性實驗

根據李婷婷等[9]、Guo等[10]和Yun等[11]人的方法稍作修改，對顏色、狀態、溶解性、雙縮脲反應、280 nm處吸收、CTAB絡合反應、I2-KI反應、斐林試劑反應、FeCl3反應、硫酸-咔唑反應進行測定。

1.7 統計分析

所有試驗均重復3次，采用Excel 2007對實驗數據計算平均值及標準差，Origin 9.0對數據進行繪圖，采用SPSS（p＜0.05）比較平均值之間的差異性并進行差異性分析。

2 結果與分析

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比的確定

由圖1可以看出，隨著水用量的增加，薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降，在料液比1∶10 g/mL時達到最大。當料液比過低，水量少，溶液過飽和，薏苡仁糖蛋白溶解不充分；隨著用水量的增加，薏苡仁糖蛋白溶解度逐漸上升。當料液比過大，能耗隨之加大，導致實驗過程中的損失加大，使薏苡仁糖蛋白提取率下降。

2.2.2 提取溫度的確定

提取溫度對薏苡仁糖蛋白得率的影響如圖2所示。薏苡仁淀粉60 ℃會發生糊化，溶于水并與其他水溶性物質同時溶出，因此，低溫提取對于提高薏苡仁糖蛋白得率是一個比較重要的因素。由圖2可以看出，隨著溫度的升高，薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降，在25 ℃時達到最佳。這可能是溫度升高，伴隨淀粉形成糊精的發生，阻礙薏苡仁糖蛋白溶出，此外過高的提取溫度會導致多糖生物活性的喪失。

2.2.3 時間的確定

由圖3可知，隨著時間的增加，薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降，在3 h時達到最佳。提取時間過短，薏苡仁糖蛋白提取不完全；隨著提取時間的不斷增加，薏苡仁糖蛋白提取率呈現下降趨勢，可能是蛋白質顆粒之間作用增強，使蛋白質易凝結而聚沉，引起糖蛋白結構上的破壞和生物活性的失活。

2.3 響應面實驗設計

低溫水提薏苡仁糖蛋白的工藝優化根據Box-Behnken實驗設計了17組實驗，5組為中心點重復實驗，如表2所示。本實驗以糖蛋白提取率作為響應值，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對IC50值Y進行多元回歸擬合。得到二次多項式擬合方程為：

回歸模型的顯著性檢驗和方差分析見表3，由表3可知，回歸方程極顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著（p=0.1098＞0.05），模型擬合程度好；相關系數R2=0.9981＞0.9，說明模型滿足了99%的樣本空間；模型中的參數A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2都是顯著的（F＜p＜0.05），顯著參數超過三分之二；同時該模型的CV=1.29%，CV值低，置信度高，說明模型方程能準確地反應實驗值，說明回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以通過該回歸方程確定低溫水提薏苡仁糖蛋白的最佳工藝條件。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析表

交互項AB、BC顯著，說明提取時間和提取溫度、提取溫度和料液比有顯著的交互作用。根據回歸方程做出三維曲面圖及等高線圖，如圖4、圖5所示。固定提取時間，薏苡仁糖蛋白提取率隨提取溫度的增加先急劇增加后略有下降；固定提取溫度，薏苡仁糖蛋白提取率隨提取時間增加先增大后減小。固定提取溫度，薏苡仁糖蛋白提取率隨料液比的增加先急劇增加后略有下降；固定料液比，薏苡仁糖蛋白提取率隨提取溫度的增加先增大后減小，并且交互作用十分明顯。這與前面的回歸方程結果相吻合。

2.4 驗證實驗結果

由Design Expert結果分析可知，薏苡仁糖蛋白最佳提取方案：料液比1∶9.72，提取溫度25.31 ℃、提取時間3.09 h，在此條件下，重復實驗5次得薏苡仁糖蛋白提取率(6.87±0.31)%，與預測值6.91%相差不大，表明響應面模型優化具有可行性。

2.5 薏苡仁糖蛋白O-糖鏈釋放前后的理化性質分析

由表4可以得到：CSGP和DCSGP均易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑。雙縮脲反應和280 nm處吸收均為陽性，說明CSGP和DCSGP均含有蛋白質。與CTAB反應呈陽性，與I2-KI反應、斐林試劑反應、FeCl3反應、硫酸-咔唑反應均呈陰性，說明CSGP為非淀粉類酸性糖蛋白，DCSGP為非淀粉類酸性糖和蛋白的混合物，均不含有還原糖、多酚、糖醛酸類物質。

表4 CSGP、DCSGP理化性質

3 結論

采用低溫水提醇沉的方法制備了薏苡仁糖蛋白，通過控制料液比、提取時間、提取溫度3個因素，以薏苡仁糖蛋白得率為指標進行單因素實驗和響應面優化實驗，得到薏苡仁糖蛋白提取率最佳體系條件為：料液比為1∶9.72 g/mL、提取時間為3.09 h、提取溫度為25.31 ℃，此條件下重復實驗5次得薏苡仁糖蛋白提取率為(6.87±0.31)%，薏苡仁糖蛋白是非淀粉類半結晶狀的酸性糖蛋白[糖含量(42.48±1.13)%、蛋白含量(27.15±1.30)%]，不含有還原糖、多酚、糖醛酸類物質。本實驗可以為進一步研究薏苡仁糖蛋白結構功能的關系和深度應用開發提供一定的理論依據。