與RABV感染相關(guān)表觀遺傳修飾酶的篩選

趙銘昕，趙維榮，徐婧，郭藝迪，張茂林

（1.吉林大學(xué)人獸共患病研究所／人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062）

狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）感染引起的一種嗜神經(jīng)性的人獸共患傳染病，致死率100%［1］。在RABV感染中，不同毒株引發(fā)的臨床表現(xiàn)差異很大，引起了研究者的廣泛關(guān)注［2］。表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA作用等。DNA甲基化是目前研究最深入的表觀遺傳修飾方式，涉及的 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要有 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L。組蛋白表觀遺傳修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，修飾過程動(dòng)態(tài)可逆，主要有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、組蛋白激酶和組蛋白泛素化酶等參與，催化修飾基團(tuán)結(jié)合到組蛋白的氨基殘基。相應(yīng)地，組蛋白去甲基化酶、組蛋白脫乙酰基酶、組蛋白磷酸酶和組蛋白去泛素化酶可去除結(jié)合在組蛋白端氨基殘基上的分子基團(tuán)。非編碼RNA最終使基因沉默從而調(diào)控基因表達(dá)［3-5］。

通常病毒感染會(huì)影響宿主細(xì)胞部分正常生理功能，本質(zhì)上就是宿主基因表達(dá)的修飾，因此病毒自身或引起表觀遺傳學(xué)的變化已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［6］。已有研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾酶參與調(diào)控多種病毒感染，例如，位于病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）上的組蛋白的去乙酰化和甲基化作用，使?jié)摲腍IV前病毒被沉默［7］；乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程依賴于病毒HBx蛋白與 LSD1和Set1A的協(xié)同作用［8］；流感病毒NP蛋白在真核細(xì)胞中通過乙酰化修飾，調(diào)控病毒顆粒的成熟和釋放［9］。已有研究發(fā)現(xiàn)，RABV街毒與固定毒株在體內(nèi)感染的細(xì)胞類型不同，而且前者引起病毒基因的轉(zhuǎn)錄水平也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于后者，并將此歸結(jié)為前者逃避機(jī)體免疫的機(jī)制［2］。對(duì)RABV病毒基因組表觀遺傳學(xué)特征進(jìn)行研究，有利于揭示不同病毒株在同類感染介質(zhì)中轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平的變化，有關(guān)RABV的同類研究也在進(jìn)行中［10］。鑒于目前RABV感染的表觀遺傳機(jī)制尚不清楚，本試驗(yàn)通過對(duì)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤（N2a）感染實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11，并在感染后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)多種類型表觀遺傳修飾酶基因表達(dá)水平變化情況，篩選參與調(diào)控RABV感染的表觀遺傳修飾酶，以期為不同RABV毒株的可行性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和毒株

BHK細(xì)胞和N2a細(xì)胞，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株CVS-11，由長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所OIE狂犬病參考實(shí)驗(yàn)室涂長(zhǎng)春研究員惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM，購(gòu)自Corning公司；胎牛血清FBS，購(gòu)自Biological Industries公司；Trizol試劑，購(gòu)自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑，購(gòu)自Bioteke；熒光定量試劑FastStart Universal SYBR Green Master，購(gòu)自 Roche。

1.3 病毒的培養(yǎng)

將BHK細(xì)胞接種在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，將CVS-11以MOI＝1接種于細(xì)胞瓶中，37℃下感作1 h后，加含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)96 h。-80℃反復(fù)凍融細(xì)胞及培養(yǎng)基3次，收取混合液，將混合液4℃、1 000 r／min離心10 min，收取上清培養(yǎng)基，分裝保存于-80℃。

1.4 病毒的感染及增殖曲線

在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種適宜密度的N2a細(xì)胞，37℃過夜培養(yǎng)后棄掉上清液，將CVS-11按照病毒量MOI＝1接種于細(xì)胞，以接種與病毒等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）為對(duì)照。37℃感作1 h，并在感染后 0、3、12、24、48 h提取細(xì)胞總RNA，對(duì)RABV N基因和相關(guān)表觀遺傳修飾酶基因進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用FastStart Universal SYBR Green Master染料進(jìn)行分析。試驗(yàn)所用RABV N基因，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，組蛋白去乙酰化酶 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC5、HDAC6，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 EZH2、MLL1、SETDB1、SUV39H1和組蛋白去甲基化酶 KDM6B、PHF8、LSD1以及內(nèi)參GAPDH基因擴(kuò)增引物見表1。

反應(yīng)體系（25μL）：上、下游引物各1μL，模板 cDNA 5μL，SYBR Green 12.5μL，ddH2O 5.5 μL，將配好的體系加入96孔板中。反應(yīng)程序：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。得到Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 5軟件，統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)。P＜0.05有差異（*），P＜0.01有顯著差異（**），P＜0.001有極顯著差異（***）。

表1 擴(kuò)增表觀遺傳修飾酶基因、RABV N基因與內(nèi)參GAPDH的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 N2a細(xì)胞上的RABV增殖曲線

為了明確RABV在N2a細(xì)胞上的增殖曲線，將不同時(shí)間點(diǎn)收集并提取的細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。結(jié)果表明，RABV感染量隨時(shí)間的推移而增加，并在感染48 h達(dá)到最大值（圖1）。

圖1 N2a細(xì)胞上的RABV N基因增殖曲線

2.2 與RABV感染相關(guān)的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶篩選

對(duì)參與甲基化的主要DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，N2a感染 RABV后，DNMT1、DNMT3a基因表達(dá)水平雖然有變化，但與對(duì)照組（ctrl）相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2 A、B）。DNMT3b基因表達(dá)水平在病毒感染12 h后極顯著下調(diào)（圖2 C）。以上結(jié)果表明，RABV感染抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3b基因的表達(dá)。

圖2 與RABV感染相關(guān)的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)量

2.3 RABV感染相關(guān)的組蛋白去乙酰化酶篩選

對(duì)參與RABV感染相關(guān)的組蛋白去乙酰化酶進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HDAC2、HDAC5基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3 B、D）；HDAC1基因表達(dá)水平24 h開始極顯著下降，下降約50%（圖3 A）；HDAC3基因表達(dá)水平下調(diào)不明顯（圖3 C）；HDAC6基因表達(dá)水平在感染RABV后各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比均極顯著下降，在感染24 h后表達(dá)水平下降50%以上（圖3 E）。以上結(jié)果表明，RABV感染抑制組蛋白去乙酰化酶 HDAC1、HDAC3、HDAC6基因的表達(dá)，且對(duì)HDAC6基因表達(dá)水平抑制最為顯著。

圖3 與RABV感染相關(guān)的組蛋白去乙酰化酶基因的表達(dá)量

2.4 與RABV感染相關(guān)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶篩選

N2a感染 RABV后，組蛋白去甲基化酶KDM6B、LSD1基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4 A、C）；PHF8在3、12、24、48 h的表達(dá)水平約下調(diào)至對(duì)照組的60%以下，差異極顯著（圖4 B）。

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶MLL1基因表達(dá)水平在感染12 h后呈上升趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4 E）；EZH2基因表達(dá)水平在感染后出現(xiàn)降低趨勢(shì)，48 h后約降低至對(duì)照組的60%（圖4 D）；SETDB1基因表達(dá)水平在病毒感染12 h后顯著下調(diào)，并在感染24 h后下降極顯著，只占對(duì)照組的14%左右（圖4 F）；SUV39H1基因表達(dá)水平在病毒感染3 h后極顯著降低，48 h后約降低至對(duì)照組的30%（圖4 G）。

以上結(jié)果表明，RABV感染顯著下調(diào)組蛋白去甲基化酶PHF8和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1基因的表達(dá)，而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1基因表達(dá)在RABV感染晚期被顯著抑制。

圖4 與RABV感染相關(guān)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶基因的表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

本研究通過對(duì)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤（N2a）接種CVS-11，探討表觀遺傳修飾系統(tǒng)在該毒株感染神經(jīng)細(xì)胞中的作用，從中篩選出與RABV感染相關(guān)且變化顯著的表觀遺傳修飾酶，以期從表觀遺傳修飾水平解析RABV引起臨床表現(xiàn)的致病機(jī)制。

已有研究表明，HIV直接感染調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs），誘導(dǎo) DNMT3b的表達(dá)增加，造成轉(zhuǎn)錄因子Foxp3高度甲基化，破壞宿主Tregs的免疫調(diào)節(jié)功能［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3b在RABV感染12 h后表達(dá)水平降低，說(shuō)明RABV可能通過調(diào)節(jié)DNMT3b表達(dá)水平影響靶基因DNA甲基化以利于RABV感染細(xì)胞，具體機(jī)制仍有待研究。甲型流感病毒NP蛋白的超乙酰化和乙酰化缺失均影響甲型流感病毒的復(fù)制［9］。過表達(dá)HDAC6可導(dǎo)致乙酰化微管蛋白減少及病毒 -細(xì)胞融合減少［12］。本研究中，HDAC6表達(dá)水平在RABV感染0 h與對(duì)照組相比呈現(xiàn)極顯著降低的趨勢(shì)，HDAC6可能通過乙酰化微管蛋白調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性進(jìn)而影響病毒侵入、胞內(nèi)運(yùn)輸、復(fù)制、出芽等感染過程。組蛋白甲基化修飾是動(dòng)態(tài)可逆的，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶在病毒感染過程中可以協(xié)同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，例如HPV的E6蛋白可以和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用并通過降低酶活性使抑癌基因P53轉(zhuǎn)錄水平降低，E7蛋白能夠催化組蛋白去甲基酶聚集到TLR9啟動(dòng)子區(qū)域最終降低TLR9的功能［13，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，RABV感染影響了組蛋白去甲基化酶PHF8和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、SETDB1、SUV39H1基因表達(dá)水平，說(shuō)明在RABV感染過程中，組蛋白甲基化酶和組蛋白去甲基化酶可能協(xié)同調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。

在病毒感染過程中，可能存在多種機(jī)制利用表觀遺傳系統(tǒng)調(diào)節(jié)生命周期中的生物活性。本研究?jī)H針對(duì)RABV感染中的表觀遺傳修飾酶進(jìn)行初步篩選，所調(diào)控的下游靶基因及具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。