高效液相色譜法測定清瘟解毒口服液中梔子苷的含量研究

楊 森，李攀登，李靈娟，王 彬，楊振豪

(河南牧翔動物藥業有限公司，河南 鄭州 451162)

當前禽類養殖業正朝著規模型、集約型趨向快速發展，致使疾病尤其是病毒性疾病群發風險被放大，科學養殖和疾病診施重要性不言自明。當今國家大力推動"減抗、替抗、無抗"的大環境下[1]，中藥以特有的多靶點、廣譜抗菌作用、無藥殘綠色安全等優勢，在病毒病防療中優勢日益凸顯。

同時，中藥制劑也以其化合物種類復雜、成分未可盡知的特點，常在藥典或質量規范中面臨操作繁雜而導致有效部位轉移率低、定量定性存在干擾等窘境。甚至相當數量中藥制劑無含量測定項，導致不同生產廠家經現有檢測標準判為合格的樣品，有效成分含量差異較大的情況，影響了產品質量的穩定性。故探索穩定及可靠的質控方法也是中獸藥發展進程的難點課題之一。

清瘟解毒口服液是一種以禽類為靶動物的中獸藥復方制劑，主治雞外感發熱[2]。該制劑含6種藥味：梔子250g、黃芩225g、連翹200g、板藍根200g、地黃150g、玄參150g。《獸藥質量標準》對該方黃芩苷、連翹對照藥材和梔子苷規范了鑒別要求，無含量測定項。目前有文獻刊登了該制劑中的黃芩苷[3]、連翹苷的定量分析方法，但對于方中用量最大的梔子未見科學系統的定量方法研究文獻。該試驗擬對淸瘟解毒口服液中梔子苷含量進行分析方法確定，并在方法學上進行適當評價，致力對本制劑的質量控制貢獻思路。

1 儀器材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AT(UVD)高效液相色譜儀；Sartorius SQP型電子分析天平；Thermo Genesys 10s型紫外可見分光光度計；超聲波清洗儀(江蘇昆山)；津騰真空抽濾泵(0.45 μm濾膜)；和泰純水儀。

1.2 試藥與試劑

梔子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110749-201718，含量97.6%)，色譜級甲醇、乙腈(天津四友)，其它試劑為分析純。

清瘟解毒口服液，由河南牧翔動物藥業有限公司(以下簡稱牧翔藥業)生產；陰性對照樣品由牧翔藥業根據國家獸藥典處方中藥味及投料量，生產出的缺梔子陰性樣品。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜條件的選擇

2.1.1 紫外可見光吸收波長選取 依實驗室處理經驗，對于糖苷類化合物多用甲醇-水系統作提取溶媒[4]，此處以50%甲醇溶解適量梔子苷對照品，供190～800 nm下紫外-可見光吸收度波譜掃描用，運行結果如圖1。預測梔子苷濃度將在優勢波峰238 nm處呈現良好紫外吸收度線性相關，選擇此寬度作梔子苷HPLC檢測波長，進行系統適用性試驗。

2.1.2 系統適用性試驗色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5?m)；流動相：乙腈-水(11∶89)；波長：238 nm；柱溫：30℃；流速：1.0ml·min-1；進樣量：20 μl。

2.2 對照品溶劑的選擇及制備

精密稱取梔子苷對照品26.75mg (含量97.6%)置100ml量瓶中，以50%甲醇溶解，定容，搖勻，作為標準儲備液。精密量取上述標準儲備液各5 mL分別以純甲醇、50%甲醇溶解至兩組25 mL量瓶中，定容，搖勻，即得梔子苷含量為52.22 μg·mL-1的不同溶媒工作標準品溶液。

過微孔濾膜，注于液相色譜儀，計算譜圖指標。其中50%甲醇溶解的對照品溶液對應譜圖的色譜峰型、柱效均優于純甲醇配制的對照品溶液對應譜圖指標。故選定50%甲醇作為配置對照品溶劑，結果如圖2。

2.3 供試品提取溶劑的選擇及制備

精密量取本品各1ml，分別置三組100 mL量瓶中，各以50%甲醇、70%甲醇、純甲醇適量溶解，超聲提取20 min后，冷卻至室溫，定容，搖勻，即得不同溶媒制備的供試品溶液。

過微孔濾膜，注于液相色譜儀，計算譜圖指標。結果如表1：

表1 不同提取溶劑的供試品色譜指標

其中，50%甲醇提取的供試品溶液對應譜圖雖柱效較高，但是分離度、峰形、以及定量表現均遜于以70%甲醇所制備者(如圖3)。故選70%甲醇作供試品提取溶劑。

2.4 空白溶液制備和專屬性試驗

精密量取陰性對照樣品1 ml，置100 ml量瓶中，以適量的70%甲醇溶解，超聲提取20 min后，冷卻至室溫，定容，搖勻，即得空白樣品溶液。

過微孔濾膜，注于液相色譜儀，采集色譜圖(如圖4)?？梢娫诒痉椒ㄉV條件下，清瘟解毒口服液中梔子苷目標峰無干擾。

2.5 線性范圍考察

精密量取梔子苷儲備液各1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、10 mL、15 mL分別置不同25 mL量瓶中，以50%甲醇定容，搖勻，過微孔濾膜，注于液相色譜儀，計算目標峰面積積分結果。以峰面積值A為因變量，濃度值C為自變量進行線性回歸解析，得：A = 3×107×C-3370.3，(R=1.0000)。表明梔子苷在進樣濃度為10.44～156.65μg·mL-1內時，與對應峰面積值所擬合的回歸方程線性相關度高。

2.6 精密度試驗

2.6.1 儀器精密度試驗 取2.2項下工作標準品溶液，過微孔濾膜，注于液相色譜儀(n=6)，同樣以2.1.2項的色譜條件洗脫，計算目標峰面積積分結果。得結果間RSD=0.19%，故所用儀器精密度高。

2.6.2 方法重復性試驗 取同一批樣品，按照2.3項下所確定的處理方法制備供試品溶液(n=6)，過微孔濾膜，注于液相色譜儀，以2.1.2項的色譜條件洗脫，并計算目標峰面積積分結果。以外標法計得梔子苷含量分別為：8.38、8.19、8.24、8.23、8.22、8.25 mg·mL-1，RSD=0.79%。

2.7 準確度試驗

取2.6.2重復性試驗項下所取的樣品1 mL，在2.3項下"置100 mL量瓶中"前精密加入梔子苷儲備液5ml，其后處理步驟與2.3項下所確定的處理方法一致，過微孔濾膜，注于液相色譜儀，以2.1.2項的色譜條件洗脫，并計算目標峰面積積分結果、測得值及回收率。結果如表2：

表2 準確度試驗結果

2.8 樣品含量測定

測量樣品取用了牧翔藥業生產的六批清瘟解毒口服液樣品，各按2.3項下所選定的樣品制備方法制取供試品溶液，過微孔濾膜，注于液相色譜儀，以2.1.2項的色譜條件洗脫，計算梔子苷含量，結果如表3：

由以上六批生產樣品檢測結果可見，牧翔藥業所生產的清瘟解毒口服液樣品含量精密度良好，批次間質量穩定，工藝可靠。

表3 樣品含量測定結果

3 小結與討論

清瘟解毒口服液方中含多味中藥，制劑企業在制備過程中為保持其性狀及藥學穩定性也不可避免加入特定輔料，成分復雜。通過系統適用性試驗發現，流動相采用國家標準中測定梔子藥材及飲片所含梔子苷的方法流動相乙腈-水(15∶85)時[5]，目標峰過早地與雜質同被洗出、分離不佳，峰形對稱性稍差，以致不能滿足對于以藥典標準所生產的該口服液樣品的成藥制劑質量標準中的定量性能需求。通過色譜條件調整，使其中雜峰更早地集中流出，縮短了實際分析周期，峰形優異，分離度良好，可以達到質控的要求。

考察了常用提取溶劑的分析效果，并通過液相色譜方法進行結果評估。最終通過條件篩選確定了70%甲醇超聲提取的前處理方法，簡便有效的同時兼備優異定量性能。

綜上，本試驗所確定含量測定方法能滿足中獸藥制劑清瘟解毒口服液中梔子苷的定量分析要求，為生產該制劑的企業質量控制提供了規范、為行業標準優化擴展貢獻參考依據。