白芨多糖提取純化新工藝的研究

雷燕妮，張小斌*， 李多偉，楊 梅，陳冬平

(1.商洛學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069；3.西安宇沐生物技術(shù)研究院有限公司，陜西 西安 710003；4.中郅實業(yè)(貴州)有限公司，貴州 都勻 558000)

白芨[Bletillastriates(Thuub) Reichb. f.]為蘭科植物白芨的干燥塊莖，有收斂、止血、清熱利濕、消腫生肌之功效[1]。它的主要藥用有效成分是白芨膠質(zhì)。經(jīng)過現(xiàn)代藥理研究，證實了白芨膠質(zhì)可以防止生成腫瘤血管，防止感染，抗腫瘤，還能加速凝血。大分子多糖是白芨膠質(zhì)的主要成分，是一種中性雜多糖，而且，可以作為質(zhì)量上等的天然增稠劑，它的成膜性能比聚乙烯醇和羧甲基纖維素鈉都要好。白芨多糖膠和機體組織很容易融在一起，機體緩慢地將白芨多糖降解吸收，而且不具備致熱原性和抗原性，因此在生物醫(yī)學(xué)材料方面，白芨多糖膠有著非常大的發(fā)展前景，除此以外，在日化產(chǎn)品的應(yīng)用中，作為化學(xué)增稠劑，白芨多糖膠完全可以替代，它對皮膚的刺激性也比較小，同時，可以延緩皮膚衰老[2～5]。筆者對白芨多糖的提取純化進行深入研究，以期獲得純度高、色澤淺、可工業(yè)化生產(chǎn)的白芨多糖提取純化新工藝，為白芨多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

紫外分光光度計(型號：UV-9000S，上海精密儀器儀表有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號：HH-4，上海力辰邦西儀器科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(型號：RE201，鄭州市申研儀器設(shè)備有限公司)；超聲萃取器(型號：HA-300，北京恒奧德儀器儀表有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(型號：SHZ-DIII，上海羌強實業(yè)發(fā)展有限公司)；電子天平(型號：SPS202F，梅特斯-托利稱量設(shè)備系統(tǒng)公司)，膜分離濃縮器(型號：KRT-D-NF，合肥科銳特環(huán)保工程有限公司)。

1.2 試劑

白芨塊莖由陜西洋縣種植基地提供，鮮莖切片后于65℃干燥后粉碎過篩(10目)，待用。

所有化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 分析測試方法 白芨多糖含量的測定 白芨還原糖采用3, 5-二硝基水楊酸法測定，白芨總多糖采用苯酚-硫酸法測定；白芨多糖=白芨總糖-白芨還原糖，用分析純葡萄糖為對照品(校正系數(shù)0.9)[6]。

白芨原料中總多糖含量的測定 稱取白芨粉末樣品5.0 g，加水100 mL，于65℃回流提取3 h，提取液中總糖含量(GT)、還原糖含量(GR)用上法測定，由下式計算出多糖含量(GP)。GP=(GT-GR)×100%

白芨多糖總提取率：

白芨多糖總提取率(%)=

2.1.2 白芨多糖單因素最佳提取條件的確定 超聲波水提法：取5.00 g白芨粉末用10、15、20倍量蒸餾水超聲波提取30、45、60 min，超聲提取1、2、3次，超聲提取溫度35℃、45℃、55℃，合并濾液，濾液減壓濃縮至1∶2(w∶v)，濃縮液冷卻后用3倍量95%乙醇進行沉淀，離心浸出上清液，沉淀物用蒸餾水加熱溶解，用100 mL容量瓶定容。

水熱回流提取法：取5.00g白芨末粉用10、15、20倍量蒸餾水45℃、65℃、85℃熱回流提取1、2、3 h，水熱回流提取1、2、3次，合并濾液，以下同上。

2.1.3 白芨多糖正交試驗確定提取的最佳條件 由2.1.2實驗結(jié)果可知，水熱回流提取法的提取率遠不如超聲波水提法的提取率，超聲波水提法為白芨多糖提取的優(yōu)選方法。故確定用正交試驗來研究超聲波水提法中提取時間、提取次數(shù)、料液比及提取溫度對白芨多糖提取的影響，以確定白芨多糖超聲提取的最佳提取條件。

2.1.4 白芨多糖中蛋白單因素確定最佳去除的條件 Sevag法除蛋白 取提取濾液，用濃度20%鹽酸溶液或20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，加入中溫型α-淀粉酶3‰(w∶v)于60℃水浴下水解3 h,除去提液中嚴(yán)重影響提取純化的淀粉成分，濾液濃縮至1∶5(w∶v)，裝入分液漏斗中，并加入0.2倍體積的氯仿及0.04倍的正丁醇。混合劇烈振蕩20 min，靜置分層，棄去有機溶劑、變性蛋白(下層)及少量糖液層，保留糖液層(上層)，將棄去部分離心，回收多糖液，重復(fù)除蛋白7次，用蒸餾水稀釋，用100 mL容量瓶定容。

酶解法除蛋白 取提取濾液，用濃度20%鹽酸溶液或20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，加入中溫型α-淀粉酶3‰(w∶v)于60℃水浴下水解3 h,除去提液中嚴(yán)重影響提取純化的淀粉成分，在調(diào)節(jié)pH至7.5，調(diào)整溶液濃度2～6 mg·100 mL-1，加入植物蛋白酶2‰～4‰(w/v)于35～55℃下攪拌酶解2～4 h，使提取液中白芨蛋白水解為白芨蛋白肽及氨基酸等，以利于與多糖的分離，粗濾，用10 000分子量超濾膜超濾，濾余液用蒸餾水稀釋，用100 mL容量瓶定容。

2.1.5 白芨蛋白正交試驗確定酶解的最佳條件 由2.1.4實驗結(jié)果可知，Sevag法除蛋白的效果遠不如酶解法除蛋白的效果，酶解法除蛋白為白芨多糖純化的優(yōu)選方法。故確定用正交試驗來研究加酶量、酶解溫度、酶解時間及底物溶液濃度對白芨蛋白酶解的影響以確定最佳酶解條件。

2.1.6 白芨多糖提取純化最佳條件的驗證 根據(jù)上述實驗結(jié)果，確定白芨多糖提取純化最佳條件為：用10倍量蒸餾水55℃超聲提取60 min，2遍，過濾，合并濾液，濾液用濃度20%鹽酸溶液或20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，加入中溫型α-淀粉酶3‰(w∶v)于60℃水浴下水解3 h，在調(diào)節(jié)pH至7.5，調(diào)整底物濃度為4 mg·100mL-1，加入3‰(w∶v)植物蛋白酶于45℃水浴下攪拌酶解3 h，粗濾，用10 000分子量超濾膜超濾，濾余液繼續(xù)減壓濃縮至稠膏狀，再在真空干燥箱中干燥、粉碎，即為白芨多糖。取樣品進行驗證試驗。

2.2 結(jié)果與討論

2.2.1 白芨多糖單因素最佳提取條件結(jié)果 白芨多糖最佳提取條件用兩種方法進行研究結(jié)果見表1。

表1 提取方法對提取率的影響 (n=5)

超聲波水提法單因素最佳提取條件為：取5.00 g白芨粉末用10倍量蒸餾水超聲波提取45 min，超聲提取2次，超聲提取溫度45℃，平均提取率為85.52%。

水熱回流提取法單因素最佳提取條件為：取5.00 g白芨末粉用20倍量蒸餾水65℃熱回流提取3 h，水熱回流提取3次，平均提取率為72.84%。

白芨多糖超聲波水提法的提取率高于白芨多糖水熱回流提取法的提取率12.66% ，白芨多糖超聲波水提法為白芨多糖提取的優(yōu)選方法。

2.2.2 正交試驗確定白芨多糖提取最佳條件結(jié)果 正交試驗條件因素見表2，正交表L9(34)及結(jié)果見表3，白芨多糖提取率直觀分析結(jié)果見表4，白芨多糖提取率方差分析結(jié)果見表5。

表2 正交試驗條件因素

表3 正交表L9(34)及試驗結(jié)果

表4 白芨多糖提取率直觀分析結(jié)果

表5 白芨多糖提取率方差分析結(jié)果

由直觀分析表4可以看出，極差最大的為A因素，其次分別為B因素、D因素，極差最小的為C因素,說明在超聲提取中，提取溫度對白芨多糖提取率影響最大，其次為料液比和提取時間，影響最小的為提取次數(shù)。由方差分析表5可以看出，有特顯著意義(F0.01

2.2.3 白芨多糖中蛋白單因素確定最佳去除條件結(jié)果 白芨多糖中蛋白去除兩種方法進行研究結(jié)果見表6。

表6 去除方法對提取率的影響 (n=5)

白芨多糖中蛋白Sevag法去除單因素最佳條件為：濾液濃縮至1 ∶5(w∶v)，加入0.2倍體積的氯仿及0.04倍的正丁醇。混合劇烈振蕩20 min，靜置分層，棄去有機溶劑、變性蛋白(下層)及少量糖液層，保留糖液層(上層)，重復(fù)除蛋白7次。

白芨多糖中蛋白酶解法去除單因素最佳條件為：底物溶液濃度4 mg·100 mL-1，加入植物蛋白酶3‰(w/v)于45℃下攪拌酶解3 h。

白芨多糖中蛋白酶解法去除效果高于白芨多糖中蛋白Sevag法去除效果，白芨多糖中蛋白酶解法去除為白芨多糖提取純化的優(yōu)選方法。

2.2.4 白芨蛋白正交試驗確定酶解最佳條件結(jié)果 用正交試驗來研究加酶量、酶解溫度、酶解時間及底物溶液濃度對白芨蛋白酶解的影響以確定最佳酶解條件。

表7 正交試驗條件因素

表8 正交表L9(34)及試驗結(jié)果

表9 白芨多糖提取率直觀分析結(jié)果

表10 白芨多糖提取率方差分析結(jié)果

由直觀分析表9可以看出，極差最大的為A因素，其次分別為B因素、D因素，極差最小的為C因素,說明酶解對白芨多糖提取率影響最大的因素為酶解溫度，其次為酶解時間和加酶量，底物濃度影響最小。由方差分析表10可以看出，有特顯著意義(F0.01

2.2.5 白芨多糖提取純化最佳條件的驗證 白芨多糖提取純化最佳條件的驗證結(jié)果如下，見表11。

表11 白芨多糖提取純化最佳條件的驗證結(jié)果

3 討論

(1)高溫(85℃-95℃)有利于多糖的溶解與浸出，由于白芨原料中淀粉含量較高，高溫使其糊化而嚴(yán)重影響白芨多糖的溶解與浸出，而超聲波提取(25～65℃)具有加速植物中有效成分進入溶劑，增加浸出率等諸多有利因素，故白芨多糖采用水超聲波提取優(yōu)于水熱回流提取。

(2)白芨多糖中蛋白酶解法去除效果不僅僅在于高于Sevag法，而且是避免了采用Sevag法有有害溶劑殘留而影響產(chǎn)品在食品、保健品中的應(yīng)用，更使得酶解法結(jié)合超濾法使白芨多糖生產(chǎn)實現(xiàn)連續(xù)化、規(guī)模化的生產(chǎn)。

(3)白芨中含有大量白芨多糖，其溶脹性嚴(yán)重影響其溶解與浸出，故采用料液比不是熱回流提取的10倍、超聲提取的6倍，而是熱回流提取的20倍、超聲提取的10倍。

(4)本工藝也為白芨多糖多肽全營養(yǎng)產(chǎn)品生產(chǎn)提供了參考。