新疆庫爾勒地區(qū)不同來源食源性葡萄球菌的耐藥性比較及相關(guān)耐藥基因檢測

王舒豐，姚曉慧，王凱，馬木爾·阿克木漢，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

葡萄球菌是造成人類食物中毒的常見致病菌之一，也是引起化膿性疾病的重要病原菌[1]。該菌廣泛分布于空氣、土壤、水中，人和動物有較高的帶菌率。因此，食品受其污染的機(jī)會很多[2]。葡萄球菌病是一種重要的人獸共患病，動物源葡萄球菌還可成為耐藥基因的貯存庫[3]。食物鏈?zhǔn)羌?xì)菌耐藥散播的重要環(huán)節(jié)，研究結(jié)果表明，耐藥菌可直接或間接通過食物鏈感染人，并具有將抗藥特性病原菌通過食物鏈轉(zhuǎn)移給人體的潛在危險[4]。在美國由葡萄球菌引起的食物中毒占整個細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%[5]。我國有多家醫(yī)院對葡萄球菌引起的食源性疾病進(jìn)行調(diào)查[6-8]，葡萄球菌所引起的食源性疾病也日益成為世界性的衛(wèi)生問題[9-10]。因此，開展食品中葡萄球菌的耐藥性調(diào)查，對食源性疾病的檢測和指導(dǎo)臨床用藥都具有十分重要的意義。本文通過對新疆庫爾勒地區(qū)各大市場及屠宰場的肉類、胴體進(jìn)行采樣，從中分離葡萄球菌，對其進(jìn)行耐藥性及相關(guān)耐藥基因檢測的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

2017年4月在新疆庫爾勒市各大批發(fā)市場、屠宰場進(jìn)行隨機(jī)采樣，共采集樣品201份。其中市場采集牛肉樣31份、羊肉樣37份，共68份市場源樣品；屠宰場采集胴體樣133份。將采集的樣品放入裝有1 mL肉湯的2 mL EP管中，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，從中分離試驗(yàn)用葡萄球菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

MH肉湯培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；BP瓊脂基礎(chǔ)、亞碲酸鹽卵黃增菌液，購自青島高科園海波生物有限公司。

1.1.3 質(zhì)控菌株及藥物

金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌ATCC29213，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

藥敏試驗(yàn)所用藥物包括：阿莫西林/克拉維酸(A/C)、頭孢噻呋(EFT)、苯唑西林(OX)、四環(huán)素(TE)、氧氟沙星(DF)、氟苯尼考(FFC)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、利福平(RP)、克林霉素(CM)。上述藥品均購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌的分離與鑒定

吸取4 μL采集的樣品至1 mL含7.5%氯化鈉滅菌肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，初步篩選葡萄球菌。培養(yǎng)后，用無菌接種環(huán)蘸取上述菌液劃線接種于BP瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。在BP瓊脂上挑取圓形、表面光滑、凸起、濕潤、顏色呈灰色至黑色的單個菌落于MH肉湯中，作為疑似葡萄球菌保存。對疑似葡萄球菌進(jìn)行革蘭染色，對鏡下觀察到紫色、呈葡萄串狀排列、無芽胞、無莢膜的菌落，進(jìn)行觸酶試驗(yàn)。用接種環(huán)取鏡檢培養(yǎng)物在一張潔凈玻片中央，滴加3%過氧化氫，觀察氣泡出現(xiàn)；若有，則為觸酶試驗(yàn)陽性，確定為葡萄球菌。

通過檢測Nuc基因來鑒定樣品中的金黃色葡萄球菌。引物合成參考文獻(xiàn)[11]，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 Nuc基因引物

1.2.2 藥物敏感試驗(yàn)

參照抗生素敏感性測試歐洲協(xié)會(EUCAST)指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用瓊脂稀釋法測定葡萄球菌對10種抗菌藥的最小抑菌濃度(MICs)。結(jié)果判定參照EUCAST(2016)標(biāo)準(zhǔn)表，以敏感、中介、耐藥3種形式對MICs值做出判定。判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 EUCAST(2016)瓊脂稀釋法葡萄球菌屬質(zhì)控范圍及MIC判定值

1.2.3 耐藥基因的檢測

根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]公布的基因序列設(shè)計(jì)erm(B)、optrA、las(E)、norA、tet(M)、femA、mecA這7種耐藥基因引物，對分離的耐藥菌株進(jìn)行上述耐藥基因的PCR檢測。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。詳見表3。

表3 耐藥基因的引物序列及目標(biāo)片段長度

1.2.4 數(shù)據(jù)的處理

耐藥率差異分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差模型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄球菌分離

經(jīng)過分離與鑒定，從201份樣品中分離出147株葡萄球菌，分離率為73.1%。市場源分離出60株葡萄球菌，分離率為88.2%；屠宰場源分離87株葡萄球菌，分離率為65.4%。未檢出Nuc基因，說明樣品中沒有金黃色葡萄球菌。結(jié)果詳見表4。

表4 不同來源葡萄球菌的分離率

2.2 不同來源食源性葡萄球菌耐藥性比較

147株葡萄球菌分離株對10種常用抗菌藥物的敏感性結(jié)果見圖1。市場源葡萄球菌對阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、苯唑西林、四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考、慶大霉素、阿米卡星、利福平、克林霉素的耐藥率依次為18.3%、23.3%、95.0%、56.7%、25.0%、1.7%、5.0%、5.0%、10.0%、53.3%。屠宰場源葡萄球菌對阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、苯唑西林、四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考、慶大霉素、阿米卡星、利福平、克林霉素的耐藥率依次為17.2%、32.2%、95.4%、64.4%、65.5%、28.7%、24.1%、2.3%、27.6%、60.9%。屠宰場源葡萄球菌對氧氟沙星、氟苯尼考、慶大霉素以及利福平的耐藥率極顯著高于市場源葡萄球菌的耐藥率(P<0.01)。而市場源葡萄球菌對阿米卡星的耐藥率極顯著高于屠宰場源葡萄球菌的耐藥率(P<0.01)。屠宰場源葡萄球菌與市場源葡萄球菌在阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、苯唑西林、四環(huán)素及克林霉素的耐藥率上差異不顯著(P>0.05)。

注：A/C.阿莫西林/克拉維酸；EFT.頭孢噻呋；OX.苯唑西林；TE.四環(huán)素；DF.氧氟沙星；FFC.氟苯尼考；GEN.慶大霉素；AMK.阿米卡星；RP.利福平；CM.克林霉素。**表示差異極顯著(P<0.01)圖1 不同食品源葡萄球菌對被檢藥物的耐藥率

2.3 不同食源性葡萄球菌多藥耐藥比較

市場源葡萄球菌以2耐(20%)、3耐(23.3%)和4耐(25%)為主，占68.3%；屠宰場源葡萄球菌在1～10耐均有分布，其中以3耐(16.1%)、4耐(16.1%)和5耐(17.2%)為主，占49.4%。耐5種以上抗生素的多藥耐藥菌株在市場和屠宰場有各自的比例，且屠宰場源比市場源更嚴(yán)重。結(jié)果詳見圖2。

圖2 不同食品源葡萄球菌多藥耐藥結(jié)果

2.4 食品源葡萄球菌中7種耐藥基因檢測結(jié)果

由表5、表6可知，147株葡萄球菌對7種耐藥基因檢測結(jié)果。葡萄球菌中四環(huán)素耐藥基因tet(M)和克林霉素耐藥基因erm(B)的檢出率最高，分別為28.6%(42/147)和24.5%(36/188)。其他耐藥基因的檢出率依次為：optrA(17.0%，25/147)；lsa(E)(4.1%，6/147)；norA(2.7%，4/147)；femA(2.0%，3/147)；mecA(0.7%，1/147)。有38株菌同時攜帶有2種或者2種以上的耐藥基因。

表5 食源性葡萄球菌耐藥基因檢出情況

表6 葡萄球菌攜帶2個及2個以上的耐藥基因型

3 討論

從新疆庫爾勒地區(qū)采集樣品201份，分離出葡萄球菌147株，分離率為73.1%，該地區(qū)的分離率要明顯高于福建地區(qū)的分離率[14]。其中市場源樣品分離率為88.2%，明顯高于嵇辛勤等[15]對市場源葡萄球菌的分離率。屠宰場源樣品分離率為65.4%。雖然屠宰加工過程中可減少胴體表面各種腐敗菌、致病菌的污染[16]，但是在運(yùn)輸以及銷售環(huán)節(jié)很可能對產(chǎn)品造成二次污染[17]。食源性葡萄球菌分離率的增高，很可能導(dǎo)致由葡萄球菌引起的感染增加，使人患病的風(fēng)險增高。此次試驗(yàn)中未檢出金黃色葡萄球菌，與王曉蘭等[18]報道的石河子市豬肉中金黃色葡萄球菌的檢測一致。因此，應(yīng)避免食品在加工、運(yùn)輸?shù)冗^程中的污染，降低食源性細(xì)菌的感染，注重食品衛(wèi)生監(jiān)管。

通過耐藥性比較，市場源葡萄球菌和屠宰場源葡萄球菌對被檢藥物的耐藥程度存在顯著差異。屠宰場源葡萄球菌的耐藥情況比市場源葡萄球菌的耐藥情況更嚴(yán)重。屠宰場源葡萄球菌的耐藥性是動物在活體狀態(tài)下使用抗菌藥物或者食用添加抗菌藥物的飼料所獲得耐藥性，而肉樣在進(jìn)入市場前都會進(jìn)行滅菌處理，所以市場源葡萄球菌可能是來自運(yùn)輸以及銷售過程中的二次污染，大部分為不攜帶耐藥性的普通葡萄球菌。這可能是導(dǎo)致屠宰場源葡萄球菌的耐藥情況嚴(yán)重的原因。市場源葡萄球菌與屠宰場源葡萄球菌對苯唑西林的耐藥率高達(dá)95%以上，與軒慧勇等[19]報道的耐藥率結(jié)果相似。這可能與當(dāng)?shù)卮罅渴褂帽竭蛭髁炙幬镏委熂膊。瑢?dǎo)致葡萄球菌對苯唑西林的耐藥率較為普遍有關(guān)。應(yīng)該減少苯唑西林在臨床的使用，可以嘗試使用敏感率較高的阿莫西林或者頭孢噻呋來治療疾病，避免濫用造成交叉耐藥。市場源葡萄球菌與屠宰場源葡萄球菌對四環(huán)素和克林霉素的耐藥率均達(dá)到60%以上，與蘇靜等[20]報道的耐藥結(jié)果相似，這可能是由于兩地在治療疾病上都采用了相同的抗菌藥物進(jìn)行治療造成的結(jié)果。屠宰場源葡萄球菌對氧氟沙星的耐藥率為65.5%，與馬木爾·阿克木漢等[21]對新疆地區(qū)養(yǎng)殖場葡萄球菌對氧氟沙星耐藥性調(diào)查結(jié)果相似。市場源葡萄球菌與屠宰場源葡萄球菌對四環(huán)素、克林霉素、氧氟沙星的耐藥率較高，臨床上應(yīng)該減少上述3種抗菌藥物的使用并及時監(jiān)測3種抗菌藥物的耐藥情況，以免出現(xiàn)多藥耐藥菌株數(shù)量暴增事件的發(fā)生。

多藥耐藥結(jié)果顯示屠宰場源葡萄球菌的多藥耐藥情況較為嚴(yán)重。市場源葡萄球菌的多藥耐藥主要集中在2～4耐，占68.3%；屠宰場源葡萄球菌多藥耐藥主要集中在3～5耐，占49.4%。市場源葡萄球菌未檢出10耐的耐藥菌，而屠宰場源檢出1株10耐的耐藥菌株，低于李靜媚[22]等報道動物肉類及其他食品的多重耐藥結(jié)果。本研究中市場源產(chǎn)品將會直接進(jìn)入居民餐桌，這可能導(dǎo)致肉樣攜帶的耐藥菌污染居民餐具，使耐藥菌進(jìn)一步傳播給人，增加人患病風(fēng)險的同時增加治療的難度。

耐藥基因的檢測能為細(xì)菌的耐藥機(jī)制以及流行病學(xué)提供更多的依據(jù)。本試驗(yàn)中選擇與抗菌藥物相對應(yīng)的7種耐藥基因erm(B)、optrA、lsa(E)、norA、tet(M)、femA、mecA進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食源性葡萄球菌中erm(B)、optrA、tet(M)基因的檢出率明顯高于其他被檢耐藥基因，且147株葡萄球菌有38株攜帶有2種及2種以上的耐藥基因。

tet(M)基因作為四環(huán)素類抗生素常見耐藥基因，通過編碼核糖體保護(hù)蛋白與核糖體結(jié)合從而阻止四環(huán)素對蛋白合成的抑制作用，使細(xì)菌對四環(huán)素類藥物耐藥[23]。本研究中的tet(M)基因的陽性檢出率為28.6%，與福建地區(qū)(23%)檢出率相近[14]，低于廣東地區(qū)(44.4%)檢出率[24]。攜帶tet(M)基因的菌株占攜帶耐藥基因菌株總數(shù)的92.1%，說明該地區(qū)食品源葡萄球菌以攜帶tet(M)基因?yàn)橹鳎沫h(huán)素類抗生素對當(dāng)?shù)仄咸亚蚓鸬募膊≈委熜Ч跷ⅲ瑧?yīng)及時停止使用，避免造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗菌作用是通過抑制細(xì)菌內(nèi)的核糖體23S rRNA基因活性，阻斷蛋白質(zhì)合成來實(shí)現(xiàn)的。其耐藥性是因甲基轉(zhuǎn)移酶erm基因催化23S rRNA基因甲基化，致使藥物與RNA親和力降低而產(chǎn)生[25]。本研究中erm(B)基因的陽性檢出率為24.5%，遠(yuǎn)低于廣東地區(qū)(43.3%)[21]、福建地區(qū)(38.3%)[14]的陽性檢出率，但與軒慧勇等[19]對新疆地區(qū)erm(B)基因的檢出率相近。這可能與地域有關(guān)，導(dǎo)致erm(B)基因的檢出率出現(xiàn)差異。

optrA基因是除cfr外，另外一個引起惡唑烷酮類和酰胺醇類類抗生素耐藥的基因。目前關(guān)于葡萄球菌攜帶optrA基因的報道不多，孫城濤等[26]、李德喜等[27]有該方面的報道，但未有關(guān)于食品源葡萄球菌中檢測出optrA基因的報道，Tamang等[28]報道了食品源腸球菌中檢測出optrA基因。本研究檢測出25株攜帶有optrA基因菌株，檢出率為17.0%。該基因的出現(xiàn)嚴(yán)重危害到人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，應(yīng)該引起人們的高度重視[29]。

綜上所述，食品源葡萄球菌對多數(shù)被檢抗菌藥都存在不同程度的耐藥，耐藥基因以erm(B)、optrA、tet(M)為主。為防止耐藥菌的傳播，應(yīng)該加強(qiáng)對屠宰場的監(jiān)管力度，提高對散戶養(yǎng)殖產(chǎn)品的收購標(biāo)準(zhǔn)。市場應(yīng)該加大對產(chǎn)品來源的調(diào)查，從源頭上防止耐藥菌向人類的傳播。