17種消毒劑對大腸桿菌、沙門菌及金黃色葡萄球菌的殺菌試驗

鄧同煒，齊亞如，石月航，郭冰潔，蔣增海，彭志鋒，徐耀輝,2*

(1.河南牧業經濟學院動物醫藥學院，河南 鄭州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技術研究中心，河南 鄭州 450046)

隨著畜禽養殖模式向規模化、集約化發展，在提高生產效率的同時，飼養密度的增加也增大了動物傳染病的傳播機率和速度[1]。除了疫苗接種和藥物防控外，做好飼養環境衛生、消毒等生物安全措施對于畜禽傳染病防控至關重要。規范的消毒措施已成為降低環境中病原微生物數量的有效手段。消毒劑在殺滅病原時所需要的濃度和作用時間也會隨著環境溫度和畜舍中有機物濃度大小等的影響發生改變。使用濃度過高的消毒液會造成對消毒劑的浪費，增加了成本，甚至會對環境造成污染和危害，使用濃度過低的消毒液會導致病原菌不能被完全殺死[2-3]。養殖場消毒作為一項經常性工作，也存在由于長期使用相同的消毒劑導致病原菌產生了耐藥性，殺菌效果降低[4]。

目前，市場上用于養殖場的消毒劑種類繁多，消毒效果也存在一定程度差異，合理選擇使用消毒劑成為消毒成敗的關鍵因素之一[5-6]。實際生產中，養殖場在選擇與使用消毒劑時，往往存在一定的盲目性。本試驗以禽源大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌為受試菌，采用懸液定量殺菌試驗比較養雞場17種常用消毒劑殺菌效果，并選擇其中9種性價比高的消毒劑，在不同濃度的有機物干擾下進行殺菌試驗，為養殖場消毒劑的選擇與使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌(菌株編號18-2-26)、德爾卑沙門菌(菌株編號18-SD-3)和金黃色葡萄球菌(菌株編號18-SA-1)由河南牧業經濟學院動物傳染病實驗室分離保存。

1.2 主要試劑

普通營養瓊脂、MH肉湯、牛血清白蛋白(BSA)。

1.3 消毒劑

試驗用消毒劑：金保安(海南育奇藥業有限公司生產)、醛力美(新鄉市百醫百順動物藥業有限公司生產)、新歐福(瑞普(天津)生物藥業有限公司生產)、戊二醛癸甲溴胺(河南后羿實業集團有限公司生產)、安滅殺(英國考文垂化學藥品有限公司生產)、樂福醛(河南大華生物技術有限公司生產)、瘟毒凈(徐州金牌藥業公司)、泛福露益溶液(廣州市畜牧科學研究所動物保健實驗藥廠生產)、氯甲酚(上海康利得動物藥品有限公司生產)、復合酚(齊魯動物保健有限公司生產)、衛可1(英國安德國際有限公司生產)、衛可2(杜邦公司生產)、安立消(瑞普(天津)生物藥業有限公司生產)、月芐三甲氯胺(江蘇康巴特生物工程有限公司生產)、百敵克(美國龍沙公司生產)、百能(廣東嘉華生物科技有限公司生產)、新潔爾滅(北京中農大生物技術股份有限公司生產)，共17種消毒劑。

1.4 17種消毒劑對3種病原菌最小殺菌濃度的確定

將17種消毒劑，采用試管二倍稀釋法[7-8]，以消毒劑推薦噴霧使用濃度為中間值，向上稀釋3個濃度，向下稀釋2個濃度。將大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌各2株分別劃線于普通營養瓊脂平板上37 ℃ 24 h，挑取單個菌落接種于5 mL營養肉湯，對比比色卡培養至0.5麥氏濃度，即1×108cfu/mL。取0.1 mL制備好的菌懸液，分別加入含有不同濃度消毒劑的肉湯中，每株菌做1個重復，放入37 ℃搖床培養18～20 h。設1管陽性對照(菌液+雙倍肉湯)，1管陰性對照(雙倍肉湯)，計數結果取平均值。

以無細菌生長的消毒劑最高稀釋度濃度為該消毒劑的最小殺菌濃度(MBC)，用平板計數方法確定。平板上菌落數≤5個，視為無細菌生長[7-8]。

1.5 不存在有機干擾物時9種消毒劑對受試菌的殺菌效果比較

根據1.4試驗結果，先將消毒劑配成各自相應的2 MBC濃度。每個離心管中加入2.5 mL 2 MBC消毒劑、2.5 mL雙倍肉湯、0.1 mL菌懸液，在不同時間點：5 min、1 h、12 h、24 h、48 h、72 h，分別取100 μL 倍比稀釋后平行涂板于普通營養瓊脂，37 ℃培養24 h計數，每個稀釋度涂培養基平板2個，結果取平均值。以無菌超純水代替消毒劑作為陽性對照，以無菌超純水代替消毒劑和菌懸液作為陰性對照[7-8]。

殺滅率=(消毒前細菌數-消毒后細菌數)/消毒前細菌數×100%

1.6 存在有機干擾物時9種消毒劑對受試菌的殺菌效果比較

1.6.1 有機干擾物濃度的選擇

將干擾物BSA預先配成0.3%、10%的濃度，根據1.5試驗結果，選擇無干擾物存在時消毒劑的最小殺菌濃度進行定量殺菌試驗，若均有細菌生長，可提高消毒劑濃度，暫定為干擾物終濃度為0.03%、1%時消毒劑的濃度分別選擇其MBC的1倍、2倍。

1.6.2 有機干擾物對消毒劑殺菌的干擾試驗

在離心管中分別加入0.4 mL菌懸液、0.6 mL干擾物、2 mL 3倍肉湯、3 mL消毒劑，進行定量殺菌實驗；在不同時間段吸100 μL 涂布于普通營養瓊脂平板，每個時間點平行涂培養基平板2個，37 ℃培養24 h計數，結果取平均值。以無菌超純水代替消毒劑作為陽性對照，以無菌超純水代替消毒劑和菌懸液作為陰性對照。

2 結果

2.1 17種消毒劑對大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌消毒效果的比較

結果如表1所示，MBC一般高于推薦噴霧濃度一倍以上，其中百敵克的MBC最小。成分為戊二醛+癸甲溴銨的四種消毒劑(金保安、醛力美、新歐福、戊二醛癸甲溴銨)中，金保安的殺菌效果最差，其余三種效果相差不大。有效成分相同的衛可1、衛可2殺菌效果相近，安立消、月芐三甲氯銨殺菌效果相近。殺滅金黃色葡萄球菌所需消毒劑最小殺菌濃度普遍低于大腸桿菌。

表1 不同消毒劑對3種病原菌的殺菌效果比較

對17種消毒劑進行綜合比較，選出9種性價比較高的消毒劑：戊二醛癸甲溴銨溶液、醛力美、新歐福、樂福醛、安滅殺、百敵克、百能、月芐三甲氯銨溶液、安立消。以每種消毒劑對大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌三種菌MBC中最低稀釋倍數的濃度進行下一步試驗。

2.2 無有機干擾物存在時9種消毒劑對受試菌殺菌效果的比較

無干擾物存在時，樂福醛對金黃色葡萄球菌殺滅效果最差，5 min、1 h、12 h、24 h均不能完全殺滅金黃色葡萄球菌，直至48 h時才完全殺滅，72 h時殺菌作用已消失，總體殺菌效果比其他8種消毒劑差。在5 min時，安滅殺、百能、醛力美即可對大腸桿菌殺滅率達到100%，但不能全部殺滅金黃色葡萄球菌；在1 h時，醛力美對金黃色葡萄球菌可100%殺滅，安滅殺、百能仍不能全部殺滅；隨著時間延長，在12 h開始對細菌殺滅率達到100%，直至72 h(72 h后未檢測)。戊二醛癸甲溴銨、新歐福、百敵克、月芐三甲氯銨、安立消在5 min即可對大腸桿菌與葡萄球菌殺滅率達到100%，直至72 h(72 h后未檢測)。結果見表2。

表2 無干擾物時9種消毒劑對受試菌的作用效果

2.3 存在有機干擾物時9種消毒劑對受試菌殺菌效果的比較

結果見表3。在0.03% BSA、1MBC消毒劑濃度下，戊二醛癸甲溴銨、醛力美、新歐福、安滅殺、百敵克、安立消6種消毒劑5min時即可對大腸桿菌殺滅率100%，直至72 h；百能、月芐三甲氯銨從1 h開始，樂福醛從12 h開始，直至72 h對大腸桿菌殺滅率100%。在同樣的干擾物濃度和消毒劑濃度下，百敵克、月芐三甲氯銨5 min時即對金黃色葡萄球菌殺滅率100%，直至72 h；戊二醛癸甲溴銨在1 h、新歐福、安滅殺、安立消在12 h、樂福醛在48 h對金黃色葡萄球菌殺滅率100%，直至72 h；醛力美直至72 h，才能對金黃色葡萄球菌全部殺滅。

表3 存在干擾物時9種消毒劑對受試菌的作用效果

將干擾物BSA濃度加大至1%、消毒劑濃度加大至2 MBC時，百敵克、月芐三甲氯銨、安立消5 min時即可對大腸桿菌殺滅率100%，直至72 h；新歐福、安滅殺、百能從1 h開始，醛力美、樂福醛從12 h開始，戊二醛癸甲溴銨從24 h開始對大腸桿菌殺滅率100%。

在同樣的干擾物濃度和消毒劑濃度下，月芐三甲氯銨在1 h，戊二醛癸甲溴銨、百敵克、百能、安立消在12～24 h對金黃色葡萄球菌殺滅率100%，樂福醛、安滅殺在72 h內均不能殺滅全部金黃色葡萄球菌。

上述研究結果表明：有機干擾物濃度越大，所需要的消毒劑濃度越高，殺滅細菌需要時間越長；9種消毒劑抗有機物干擾能力不同；在相同濃度的有機物干擾下，消毒劑對不同細菌的抗干擾能力也不相同，殺滅金黃色葡萄球菌所需時間長于大腸桿菌。月芐三甲氯銨、百敵克、安立消、新歐福抗有機物干擾的能力較強。

3 討論

大腸桿菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌是重要的人獸共患病原菌，對動物和人的危害巨大。雞舍中上述3種菌廣泛存在[1,9-10]。因此，本研究選擇這3種細菌進行試驗，具有一定代表性。本研究中17種消毒劑殺滅金黃色葡萄球菌最小殺菌濃度普遍低于大腸桿菌，可能與細菌細胞壁結構有關，其他研究者也有相似的報道[11]。其中安滅殺、安立消以及月芐三甲氯銨的MBC均小于推薦噴霧濃度；樂福醛、瘟毒凈的的MBC均大于推薦噴霧濃度，也高于毛倩倩等[12]的報道。其余12種消毒劑的MBC值與推薦噴霧使用濃度基本一致。17種消毒劑之間消毒效果均存在差異,即使成分完全相同的消毒劑，其最小殺菌濃度也不同，比如成分相同的4種消毒劑(金保安、醛力美、新歐福、戊二醛癸甲溴銨)，金保安對3種試驗菌株MBC大于推薦使用濃度的4～5倍，其余三種除對金黃色葡萄球菌MBC與推薦使用濃度一致外，對大腸桿菌、沙門菌MBC均大于推薦使用濃度；主要成分相同的安立消、月芐三甲氯銨消毒效果相差不大，但其MBC值均大于王繼[13]和李雯等[14]的報道；復合酚的MBC值大于李寶棟等[15]報道的復合酚對總菌落數的殺菌效果，瘟毒凈的MBC小于李雯等[14]的報道。

畜禽養殖場消毒會受到消毒對象、有機物、溫度、作用時間、污染物、消毒方式等因素的影響[16-18]，因此消毒時需根據消毒對象選擇適宜的消毒劑并適當調整使用濃度，以期達到較好的消毒效果。本研究使用不同濃度干擾物模擬養殖環境潔凈程度差異，干擾物濃度≤0.03%時，模擬環境潔凈度較好的養殖場；干擾物濃度為1%時模擬環境潔凈度較差的養殖場。試驗結果表明，有機干擾物濃度越大，所需要的消毒劑濃度越高。戊二醛癸甲溴銨、醛力美抗干擾能力較弱，月芐三甲氯銨、百敵克、安立消、新歐福抗有機物干擾的能力較強。根據本研究結果，建議消毒時使用月芐三甲氯銨、百敵克、安立消、新歐福4種消毒劑輪換使用。環境潔凈度較差的養殖場，消毒前盡可能提高潔凈度，并且通過加大消毒劑濃度至推薦使用濃度的2～4倍，延長消毒時間保證消毒效果。

細菌的抗生素和消毒劑存在共同耐藥現象[19]。為減少細菌對消毒劑的抗性及食品安全風險，養殖場要定期清潔，保持良好的養殖環境[20-21]。不同消毒劑的消毒效果存在差異，建議具備條件的養殖場選用消毒劑時，結合實驗室手段，對比不同消毒劑的MBC值，合理選擇及使用消毒劑。