缺氧誘導因子-1α在牦牛肺臟中的表達及分布情況

趙曉萌，買雨晨，喬自林,2,3 ，楊 琨,2*

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730100;2.西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030;3.西北民族大學生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

牦牛是我國以青藏高原為起源的高原特種動物，能在海拔3 000～4 000 m左右、氧分壓在11 600～14 500 Pa的高寒氣候中正常生存，其生長發育、新陳代謝等各方面的生理機能與當地的環境形成了良好的適應機制，是研究高原生物低氧適應性的良好材料。

異源二聚體缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1）由氧不穩定的α亞基和氧穩定的β亞基組成[1]，是維持體內氧環境穩定、調節氧需求與供應的重要因子。缺氧誘導因子-1α作為能決定缺氧誘導因子-1活性的唯一氧調節亞單位[2]，要想發揮其功能必須要保持其穩定性, HIF-1α蛋白的穩定性是由氧依賴性和非氧機制調節的[3]。在正常氧氣濃度下，HIF-1α經泛素化迅速降解[4]后表達很少。在低溫缺氧條件下，HIF-1α與HIF-1β形成二聚體入核后結合HRE，使缺氧表達下顯著增高[5]。此外，HIF-1α還能夠介導能量代謝、細胞的生長和凋亡、血管新生、氧的攝取和運輸等表達，參與細胞內氧平衡狀態的調節[6]。

本研究以牦牛肺臟作為實驗樣本，應用石蠟切片、HE染色和免疫組化的方法來探索HIF-1α在牦牛肺部的表達及分布情況以及HIF-1α對高原動物低溫缺氧的作用，具有高度的創新性和研究價值，旨在進一步為HIF-1α對高原動物低氧性的機制提供理論依。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 甘肅省臨夏回族自治州某屠宰場采集牦牛健康肺臟。經宰割后迅速將牦牛肺臟樣本放于4%的多聚甲醛中固定。

1.1.2 試劑與儀器 0.01mol/LPBS磷酸鹽緩沖液，0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液，兔多克隆抗體HIF-1α（bs-1313R）、免疫組化試劑盒（SP-0023），DAB顯色試劑盒（DA1015-3)，均購于北京博奧森生物技術有限公司，病理組織切片機、顯微鏡照相系統等。

1.2 HE染色及免疫組化SP染色

1.2.1 蘇木精-伊紅染色 牦牛肺臟樣本經梯度乙醇脫水、常規石蠟包埋后，切成石蠟切片（厚4 μm），隨后進行脫蠟，染色，脫水透明，封片，其具體的HE染色方法按說明書來進行。

1.2.2 免疫組化SP染色 HIF-1α兔多克隆抗體濃度稀釋1:100，按抗體說明書4℃冰箱凍藏，用前及時解凍。石蠟切片脫蠟復水后，用PBS浸泡5 min后進行經抗原修復、阻斷劑阻斷、封閉液封閉，滴加一抗孵育，陰性對照組不加入兔多克隆抗體HIF-1α。滴加DAB顯色液（現用現配）。光鏡下觀察顯色，適宜可終止反應。自來水沖洗10 min后按HE染色步驟進行蘇木精復染至封片鏡檢。

1.3 圖像采集及結果判定

將染色完成的切片放置于顯微鏡照相系統下采集信息圖像。免疫組織化學染色后在顯微鏡下根據著色程度可呈現出強陽性、中性陽性、弱陽性和陰性表達四種結果。若HIF-1α在胞漿、胞核呈現深棕黃色或黃褐色則為強陽性表達、棕黃色較淺是弱陽性表達、處于二者之間是中性陽性表達、未出現棕黃色或與背景色相似的是陰性表達。

2 結果與分析

2.1 牦牛肺臟的組織學結構

牦牛肺臟內支氣管分支、大量肺泡及肺泡間隔組織。終末細支氣管環行平滑肌較為明顯且完整，肺泡多為半球型小囊，或圍成肺泡管、肺泡囊，可見肺泡上皮細胞。由I型上皮細胞包覆的肺泡壁較薄（見圖1）。

圖1 牦牛肺臟組織切片HE染色結果

2.2 免疫組織化學中的表達

HIF-1α在牦牛肺臟組織呈廣泛性表達。依據免疫組化結果展示HIF-1α在細胞表達陽性顏色的深淺可知，肺泡、終末細支氣管環形平滑肌呈現棕黃色，為強陽性表達。肺泡隔間充質細胞質呈中性表達且少量表達。細胞核內呈陰性表達（見圖2）。

圖2 牦牛肺臟HIF-1α蛋白免組織化學檢測結果

3 討論

肺臟是機體在高原環境下最先進行代償的器官，也是動物機體與外界進行氣體交換的場所。長期生活在低氧環境的牦牛的肺氣-血屏障較薄，能在氣體交換過程中更有利于單位時間內的氧氣交換量[7]。對于肺臟不同結構HIF-1α表達的功能也不同。在肺臟中毛細血管對HIF-1α存在依賴，且肺泡-毛細血管屏障功能對肺臟起著重要調控作用，當其功能發生紊亂時會導致嚴重的肺水腫、肺損傷等情況[8]；在肺泡肺氣管發育中能調控血管網絡的形成，當肺血管發育不足時會造成肺泡的形成不良[9]；在生長因子的內皮細胞中HIF-1a能調控其表達，通過增強血管的通透性促進肺動脈平滑肌細胞增殖[10、11]，以此來誘導血管生成因子的生成與表達，維持血管的平衡。

HIF-1α作為低氧調控的關鍵介質，在常氧下幾乎不發生表達，在缺氧時呈高度表達。HIF-1α不僅能促進細胞的增殖分化，還能介導炎癥的形成產生。在低溫缺氧條件下，HIF-1α能夠激活血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)等來促進肺血管的重構，從而使組織細胞保持耐受低氧穩定狀態[12]，參與細胞代謝、血管收縮、炎癥、氧的攝取等多種生理病理過程,在各種細胞組織中發揮作用。但也會通過激活不同的炎癥因子引起肺急性肺損傷、肺癌、慢性阻塞性肺炎等病癥。當肺小動脈肌化作用加強, 誘導基質細胞和肺動脈外膜成纖維細胞增殖造成肺血管重構時,則會引發肺動脈高壓[13]。但也有研究表明HIF-1α的部分缺失會使肺動脈高壓癥狀減輕，以此說明對HIF-1α慢性缺氧引起的病理變化具有保護作用[14]。

有學者已經得出HIF-1α在牦牛的心臟中表達程度最高，其次是肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織[15]的結論，證明HIF-1α在肝臟存在表達。本研究則得出HIF-1α在牦牛肺臟中的肺泡管、終末細支氣管環形平滑肌中呈現高度表達的情況，HIF-1α大量分布于肺的導氣部，表明低溫缺氧能刺激HIF-1α在肺導氣部的表達，從而對牦牛的生長發育產生影響。

4 結語

本研究顯示缺氧誘導因子-1α在牦牛肺臟中的肺泡管、終末細支氣管環形平滑肌中呈強陽性，肺泡隔間充質細胞質呈中性表達且少量表達，在細胞核內呈陰性表達。以此得出低溫缺氧的條件下牦牛肺臟能夠表達缺氧誘導因子-1α的特性，進而推測缺氧誘導因子-1α對高原動物低溫缺氧適應性起著重要調節作用。