sIgA細胞在初生牦牛小腸的分布研究

宋 晨，張 倩，崔 燕，何俊峰，拜占春，劉嘉琪，馬志宏

（甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

小腸（Small Intestine）是動物消化系統關鍵的組成部分之一，由十二指腸、空腸、回腸共同構成。小腸不僅能夠消化食物，而且還能夠很好地吸收營養物質，不僅如此，小腸同時還能起到免疫屏障的作用。當前，關于小腸組織結構進行的研究與報道，主要是集中于兔、貓、羊[1]、以及藏羚羊[2]等動物。根據這些研究報道顯示，小腸壁層的構成包括了黏膜層、黏膜下層、肌層以及漿膜，而且小腸黏膜上還具有微絨毛、腸絨毛、環形褶皺以及小腸腺等具有代表性的結構。除此之外，在小腸黏膜上面還分布有很多與黏膜有關的淋巴樣組織，包括有淋巴細胞、肥大細胞、巨噬細胞等等。小腸黏膜組織所具有的這些結構不僅能夠增大小腸黏膜的表面積，而且還可以提高小腸對營養物質的吸收效率，同時小腸組織中相關細胞還參與構成了腸道的免疫防御屏障，這些使得小腸黏膜兼具了良好的吸收作用和屏障功能。

消化道黏膜免疫的主要效應因子為分泌型免疫球蛋白A(secretoryIgA，sIgA)，同時消化道黏膜免疫系統的首要防線也是由sIgA而構成的。首先，sIgA不僅能夠中和病毒、抵御病原菌，其次，它還能夠實現免疫清除、免疫排斥。除此之外，sIgA還可以調節腸道的微生物構成情況，并且還可以促使形成得到更多的天然抗菌因子[3]。當前，關于消化道sIgA細胞分布情況的研究，主要集中在豬、家兔、雙峰駝等動物[4-6]且均已有報道。

牦牛是主要分布在我國青藏高原等地區的特有牛種之一，能夠很好地適應高寒的氣候環境。牦牛不僅僅可用于農耕，而且還能夠作為高原運輸工具，更可以為當地牧民提供奶、肉、皮毛、役力、燃料等生產生活必需品，是高原地區不可或缺的生活和經濟來源，這也使牦牛成為當地畜牧業經濟中起到支柱性作用的重要畜種。但是，由于牦牛所生活的環境多處于高原地區，自然條件特殊，環境惡劣，再加上牧區牧民的飼養管理技術較為落后以及病原性等因素的影響，使得犢牦牛腹瀉發病率很高，這已成為導致犢牦牛死亡最常見的病因之一。后煥文等[7]調查表明，甘南犢牦牛腹瀉平均發病率為17.57%，平均病死率則高達44.91%，這已經使當地牦牛業的健康發展受到了嚴重危害。因此，了解初生牦牛小腸的早期形態結構及sIgA黏膜免疫效應細胞的分布特征，對采取有效的措施加強初生牦牛的飼養管理、減少犢牦牛腹瀉疾病的發生從而降低發病率和病死率，最終對提高犢牦牛成活率具有重要意義。

綜上，sIgA細胞在初生犢牦牛小腸中的分布規律，目前還未見相關報道。因此，本研究選取初生牦牛為研究對象，研究其小腸黏膜組織結構及sIgA細胞的分布規律，以期為犢牛消化道疾病的預防、治療及疫苗的開發等方面提供重要的免疫學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究總共選取5例健康的1～7日齡犢牦牛作為研究對象，待牦牛頸動脈放血處死之后，再剖開腹腔，自幽門后1 cm至盲腸口前0.5 cm整段截取，完整取出其十二指腸、空腸、回腸，接著再使用生理鹽水將采集的樣本都徹底沖洗干凈。之后，將每個腸段都劃分為5份，分別固定在40 g/L中性多聚甲醛溶液中，同時，對每一個腸段都做好標記。小腸組織樣全部采集自甘肅省甘南藏族自治州合作屠宰場，

SP試劑盒、DAB染色試劑盒、家兔抗IgA多克隆抗體（rabbit polyclonal to IgA）以及載玻片蓋玻片等均向某生物技術有限公司采購。

1.2 組織學切片染色觀察

對采集回來的小腸組織先進行分段處理，標明十二指腸、空腸、回腸，再對每個腸段組織進行切塊，每個組織塊約為1cm3，每個腸段各取5個組織塊。依次經過脫水、透明、浸蠟后，常規石蠟包埋，待蠟塊凝固后作適當修整，確保蠟塊的各個邊緣都是整齊的，規格大小也都是適宜的，之后將蠟塊放置到切片機上做連續切片，切片厚度均為5μm，每例各選取5片，HE染色觀察小腸基本結構。

1.3 sIgA細胞分布觀察

免疫組織化學染色使用家兔抗IgA多克隆抗體，使用時需按照 1/100稀釋之后再使用。并且在免疫組織化學的染色時，實際操作流程及步驟應當按照SP試劑盒詳細說明書進行。染色時可用0.01 mol/L的PBS緩沖液取代一抗作為空白對照，同時，應用Olympus-DP71顯微鏡在鏡下觀察陽性細胞的實際分布情況，并且拍照保存。

2 結果

2.1 初生牦牛小腸組織形態結構

通過組織切片經HE染色觀察發現，初生犢牦牛小腸壁層組織共由4層構成，分別包括黏膜層、黏膜下層、肌層以及漿膜層。黏膜層則由3層構成，包括了黏膜上皮、固有層、黏膜肌層。在顯微鏡下，可以清晰地觀察到十二指腸絨毛呈葉狀形態，相較于空腸和回腸更為粗短，且排列更為緊密(見圖1A)；空腸絨毛為長桿狀，細長且排列稀疏（見圖1B），回腸絨毛長度較短且排列稀疏，并且還可觀察到局部絨毛表面出現類似腦溝回形的皺襞（見圖1C）。小腸的絨毛上皮細胞基本上均為單層柱狀上皮細胞，并且在上皮細胞之間還散在分布有杯狀細胞和淋巴細胞。另外，小腸腺作為小腸組織的代表性結構之一，在十二指腸、空腸、回腸三者的黏膜固有層中均可觀察到。并且在十二指腸黏膜下層中可清晰觀察到十二指腸腺，空腸黏膜下層除腸腺外還可觀察到有少量散在分布的淋巴小結，呈圓形或橢圓形，著色較深。回腸黏膜下層中則可見大量集合淋巴小結。

圖1 初生牦牛小腸黏膜結構 HE染色 100×

2.2 初生牦牛小腸sIgA細胞的分布

本研究觀察到sIgA細胞在小腸各結構中均有分布，并且在腸絨毛基部固有層中的分布量最多（圖2A-C）。不同腸段當中sIgA細胞的分布情況是不相同的，十二指腸上主要分布在絨毛基部固有層以及十二指腸腺附近，空腸中sIgA細胞基本上分布在絨毛固有層之中，回腸當中則是以富含淋巴細胞的絨毛和集合淋巴小結當中為主，此外，在回腸絨毛上皮中也有少量分布。

圖2 初生牦牛小腸IgA+細胞的免疫組織化學反應 1000×

3 討論

本研究所得結果表明，初生牦牛小腸管腔組織結構從內到外共由4層構成，分別依次為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜組成。黏膜層的基本構成又可分為3層，包括了黏膜上皮、固有層以及黏膜肌層。為了增加機體對于營養物質的有效吸收，小腸黏膜層內的固有膜會向管腔內突起形成連續的褶皺，并且在其表面覆蓋了上皮細胞從而形成了腸絨毛，同時在顯微鏡下還可清楚觀察到肌層有內側環形肌和外側縱形肌兩層。在小腸的黏膜固有層中均有小腸腺分布其中，這是小腸的代表性結構之一。十二指腸腺緊密排列在十二指腸的黏膜下層中，空腸黏膜下層偶爾可見散在分布的淋巴小結，回腸黏膜下層中則可見大量集合淋巴小結，這些研究結果和常蘭等人[2]針對藏羚羊和藏綿羊的小腸結構所進行的研究結果是一致的，表明初生牦牛小腸結構完整，已具備一定的消化吸收能力。

黏膜免疫系統屬于動物免疫系統當中最重要的構成部分之一，此系統會分泌大量sIgA，sIgA則會和病原微生物抗原結合形成抗原抗體復合物。此外，其還能夠刺激消化道黏膜中的杯狀細胞，促使杯狀細胞分泌大量黏液，從而可以有效抵御并清除動物體內的各種寄生蟲[8]。根據本研究結果可知，sIgA細胞在初生牦牛十二指腸、空腸、回腸上主要分布于黏膜固有層，而在腸絨毛上的分布量較少。這個結果與楊倩等人的研究結果也相符合[9]。筆者分析sIgA細胞在小腸中這樣分布的原因可能與固有層結構疏松，從而更有利于其分泌并轉移的IgA向周圍擴散，進而可以達到更好的局部免疫效果有關。不同腸組織當中sIgA細胞的分布情況是不相同的，十二指腸上主要分布在絨毛基部固有層以及十二指腸腺附近，空腸中sIgA細胞基本上分布在絨毛固有層之中，回腸當中則是以富含淋巴細胞的絨毛和集合淋巴小結當中為主，此外，在回腸絨毛上皮中也有少量分布，本結果和車傳燕等研究結果也相符合[4]。小腸黏膜sIgA細胞無論是十二指腸、空腸還是回腸，都主要分布在腸絨毛基部的腸腺周圍，但是有一點需要注意，那就是腸絨毛下的 sIgA細胞局部密度是明顯低于腸腺周圍密度的，這樣就可以說明腸腺很可能就是sIgA進入腸腔的主要途徑，這可能為動物機體小腸不同部位發揮不同程度的免疫功能提供了重要的理論基礎。