液質聯用法測定雞肉中甲基睪酮的不確定度評定

焦紹明，李卿沛，代春梅，徐尚喜

（金昌市農產品質量安全檢測中心，甘肅 金昌 737100）

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1290-6460C型液質聯用儀（美國Agilent公司）；IKA VXR渦旋振蕩器（艾卡公司）；Smart-N30VF超純水機（力康公司）；感量為0.01 g、0.1 mg的電子天平（德國賽多利斯公司）；1 000 μl移液器（德國普蘭德公司）；Agilent Bond Elut C18固相萃取柱（500mg/3 ml，Agilent公司）。

甲基睪酮標準品：50mg，Stanford Chemicals。乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher公司。試驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制 準確稱取10 mg甲基睪酮標準品，用甲醇定容至于100 ml容量瓶中，配制成100 mg/L的標準儲備液。取0.1 ml標準儲備液用甲醇定容至10 ml，配制成1mg/L的標準中間液，于-18℃冰箱中保存。

1.2.2 前處理方法 稱取2 g糜狀雞肉樣品于50 ml離心管，加入10 ml乙腈，渦旋振蕩5 min，超聲提取10 min，10 000 r/min離心10min，取上清液至雞心瓶，殘渣重復提取一次，合并上清液于雞心瓶中，40℃負壓旋蒸至干，加入5ml 30%甲醇水溶液溶解殘余物，待凈化。

C18固相萃取柱預先用3ml甲醇、3ml水活化，上述待凈化溶液全部過柱，用2 ml30%甲醇水溶液淋洗小柱，抽干后使用3 ml90%甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液于40℃下氮氣吹干，用1 ml 50%甲醇水溶液溶解殘渣，過0.22μm微孔有機濾膜后待檢測。

1.3 儀器條件

色譜柱為AgilentZORBAXSB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫為35℃；流動相A為含0.1%甲酸的超純水，B為含0.1%甲酸的乙腈；液相流速為0.25 ml/min；梯度洗脫為0 min 90%A，2 min 60%A，4 min 40%A，6 min 15%A，7 min 20%A，9 min 90%A。電噴霧正離子模式（ESI+）；多反應監測（MRM）；甲基睪酮離子對：303.2/109（定量）、303.2/97.1；傳輸電壓為119V。

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1.4 基質匹配標準溶液配制

取空白雞肉樣品按照前處理步驟制備基質溶液，用基質溶液將標準中間液逐級稀釋成濃度為200 μg/L、100 μg/L、50 μg/L、20 μg/L、10μg/L、5 μg/L的基質匹配標準溶液。

1.5 建立數學模型

甲基睪酮含量計算公式：

式中：X為樣品中甲基睪酮的含量（μg/kg）；C為樣品中甲基睪酮濃度（μg/L）；V為樣品最終定容體積（ml）；m為樣品質量（g）。

2 不確定度分量主要來源

2.1 配制標液引入的不確定度

由標準品純度以及配制標準品使用的天平、移液管、容量瓶等的最大允許誤差引入。

2.2 樣品稱重引入的不確定度

由稱重天平的最大允許誤差引入。

2.3 最終定容體積引入不確定度

由最終定容體積使用移液器的最大允許誤差引入。

2.4 標準曲線引入的不確定度

由最小二乘法擬合標準曲線校準C引入。

2.5 實驗回收率引入的不確定度

由前處理步驟對回收率的影響引入。

2.6 液質聯用儀引入的不確定度

由儀器檢測過程引入。

3 測量不確定度的計算

3.1 配制液引入的不確定度

3.1.1 標準品純度引入的不確定度 標準物質證書給出甲基睪酮標準品的純度為98.85%±1.0%，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

3.1.2 配制標準儲備液引入的不確定度 根據檢定證書，感量0.000 1 g電子天平的最大允許誤差為±0.001 5g，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

根據檢定證書，100 ml容量瓶的最大允許誤差為±0.1 ml，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

3.1.3 配制標準中間液引入的不確定度 根據檢定證書，0.1 ml移液管的最大允許誤差為±0.004 ml，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

根據檢定證書，10 ml容量瓶的最大允許誤差為±0.02ml，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

3.1.4 配制標液引入的相對標準不確定度

3.2 樣品稱重引入的不確定度

根據檢定證書，感量0.01g電子天平的最大允許誤差為±0.05g，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

3.3 最終定容體積引入的不確定度

根據檢定證書，1 000 μl可調式移液器的擴展不確定度為0.5μl（k=2），引入不確定度為：

3.4 標準曲線引入的不確定度

配制5、10、20、50、100、200μg/L等6個濃度的基質匹配標準工作液，分別測試3次，測量結果用最小二乘法擬合得到線性回歸方程：y=303.38x-266.31（R2=0.9992），=64.167μg/L，峰面積測量的標準偏差S為：

配置濃度為50μg/L的基質匹配標準溶液，重復測定6次，峰面積結果見表1，測定樣品中甲基睪酮含量的平均值C0=50.79μg/L。

引入不確定度為：

3.5 試驗回收率引入的不確定度

稱取2 g空白雞肉樣品，添加甲基睪酮標液至20 μg/kg，做6個平行樣品進行測定，計算其含量和回收率，含量平均值=20.38μg/kg，回收率見表2。

引入不確定度為：

3.6 液質聯用儀引入的不確定度

根據檢定證書，液質聯用儀的不確定度為U=10%，k=2，引入不確定度為：

3.7 合成相對標準不確定度及擴展不確定度

3.7.1 各分量合成相對標準不確定度

3.7.2 擴展不確定度

取包含因子k=2，在95%置信水平下，甲基睪酮擴展不確定度為：

3.8 結果報告

4 結論

通過對不確定度引入各個分量的評定來看，液質聯用儀測定、標液配制和回收率引入的不確定度較大，在實驗中應盡可能規范操作，以提高測量精確度。

表1 重復進樣測定結果峰面積

表2 雞肉中甲基睪酮加標回收測定結果