二次諧波和偏振光影像技術在燒燙傷小鼠瘢痕膠原纖維病理變化中的應用

賀改英，唐靖惠，馬淑驊，孫婭楠，楊偉峰，王 毅*

（1.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700；2.吉林農業大學中藥材學院，長春 130118）

燒燙傷引起的瘢痕發病率高［1］，在一項為期5年的多中心隨訪研究調查中發現，在平均燒傷面積為10%體表面積的患者中，有78.9%燒燙傷患者有瘢痕［2］。瘢痕不僅影響美觀，伴隨著瘙癢和疼痛［3］，而且瘢痕的攣縮常引起關節活動受阻，這些對患者的心理和生理均產生了重要影響［4-6］，所以早期防治和評估燒燙傷瘢痕至關重要。膠原纖維是細胞外基質的主要成份，占真皮的70%～85%，燒燙傷后膠原纖維的變化直接影響了瘢痕的愈后、皮膚彈性和拉伸強度等功能，所以活體動態評估瘢痕部位膠原纖維的病理改變，可為藥物篩選和臨床治療提供指導。

目前評估創傷愈合瘢痕形成過程主要是通過肉眼觀察拍照評估，它只能記錄創口表面表征，有一定的主觀性，容易造成試驗結果的誤判。研究皮膚深層的變化是主要通過取材后對瘢痕組織的膠原纖維進行病理染色，但這種方法不能定量檢測膠原纖維的排列和密度等方面的信息。液晶偏光成像方法是近年來在皮膚創傷檢測中新興的試驗技術，它通過對雙折射特性明顯的物質（如膠原纖維）進行定性和定量檢測，反應皮膚深層結構信息，與病理染色方法相比有絕對的優勢。

本試驗通過二次諧波（second harmonic generation，SHG）成像技術活體、動態、無創檢測瘢痕組織乳頭層和網狀層膠原纖維的排列規律和和密度變化，并與液晶偏光影像系統相對照，旨在通過總結規律，用光學成像技術建立一種活體快速、可定量的評估方法，為預防和治療瘢痕形成的藥物治療提供檢測方法，為瘢痕形成相關疾病的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

C57BL/6Cnc小鼠，12只，雄性，6～7周齡，體重（20±2）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2016-0006。將其飼養于12 h光照/12 h 黑暗的環境中，自由攝食和飲水。

1.1.2 主要儀器與試劑

4%多聚甲醛（中國，索萊寶公司）；異氟烷（中國，瑞沃德公司）；雙光子掃描顯微鏡（日本，Olympus公司）；液晶偏光影像系統（美國，CRi Abrio公司）；石蠟切片機（美國，Thermo公司）；小動物麻醉機（中國，瑞沃德公司）；倒置顯微鏡（日本，Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立和試驗分組

12只C57BL/6Cnc小鼠隨機分為2組，即正常對照組（sham）和瘢痕組（scar）。C57BL/6小鼠被適應性飼養1周后，經麻醉后背部進行剃毛和脫毛處理。對文獻［7］中動物燒燙傷模型的構建方法進行改良建立小鼠燒燙傷模型。scar組使用96.5℃的水蒸氣在背部胸椎段中間部位造模6 s，建立創傷面為1 cm直徑的深度燒燙傷模型，使用傷口敷料進行包扎。72 h后模仿臨床燒燙傷處理方法去除結痂，常規飼養6個月。

1.2.2 SHG成像技術

各組小鼠麻醉后固定于雙光子顯微鏡載物臺上，采用激發波長為850 nm［8］，數值孔徑為1.05的25倍水浸顯微物鏡對真皮組織進行z軸掃描，步進5μm，圖像采集像素為 1 024 pixel×1 024 pixel，420～460 nm濾光片收光，采集速度4μm/pixel，觀察正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍乳頭層和網狀層膠原纖維，通過Java圖像處理與分析軟件（image processing and analysis in Java，Image J）分析膠原纖維排列方向和膠原纖維面密度，其中膠原纖維面密度是膠原纖維所占面積占總面積的比值。

1.2.3 液晶偏光影像技術

各組小鼠取相應部位組織，將其置于4%多聚甲醛中固定48 h，經過修剪、脫水后，將組織進行包埋，切厚度為6μm的切片，進一步脫蠟，通過液晶偏光影像系統觀察正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍乳頭層和網狀層的膠原纖維，并通過系統自帶軟件對膠原纖維方位角變異程度和相位差進行定量分析。

1.3 數據處理

一致性、密度、方位角及相位差數據均通過GraphPad Prism 6軟件計算；所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行統計處理，組間比較采用單因素方差分析，以±s表示，P＜0.050為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 燒燙傷瘢痕和瘢痕周圍外觀的觀察

常規飼養正常和燒燙傷小鼠6個月后，對正常皮膚和瘢痕部位進行拍照，觀察小鼠正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍的外觀（圖1）。試驗結果發現瘢痕部位皮膚顏色偏暗，與周圍皮膚顏色不一致，而且瘢痕部位沒有毛發生長。

圖1 造模6個月后，小鼠正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍外觀Fig.1 Appearance of normal skin, scar and scar edge after six months of burns

2.2 SHG成像技術研究燒燙傷瘢痕膠原纖維的病理變化

2.2.1 SHG成像技術研究燒燙傷瘢痕膠原纖維排列的變化

為了從皮膚水平面研究正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍水平面膠原纖維的排列，我們通過SHG成像技術檢測乳頭層和網狀層膠原纖維，并通過Image J軟件分析膠原纖維排列方向。正常皮膚乳頭層膠原纖維纖細，網狀層膠原纖維粗大，不管是乳頭層還是網狀層，其膠原纖維各個方向均有排列，呈隨機排列的網狀結構（圖2a、2b）。 瘢痕部位乳頭層和網狀層膠原纖維排列方向一致，與表皮平行（圖2a、2b），與正常皮膚比較，瘢痕部位乳頭層和網狀層膠原纖維排列一致性均明顯增加（P＜0.050，P＜0.050）。瘢痕周圍膠原纖維排列與瘢痕部位相似，與表皮呈平行排列（圖2a、2b）。如圖2c所示，與正常皮膚比較，瘢痕周圍乳頭層和網狀層膠原纖維排列一致性均顯著增加（P＜0.010，P＜0.010）。這些結果表明，從水平面觀察瘢痕和瘢痕周圍乳頭層和網狀層的膠原纖維，其排列方式發生了改變，這種改變會影響皮膚正常彈性和拉伸性能的發揮。

2.2.2 SHG成像技術研究燒燙傷瘢痕膠原纖維面密度的變化

為了從皮膚水平面分析正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍皮膚水平面膠原纖維面密度的變化，本試驗通過圖像處理與分析軟件Image J對乳頭層和網狀層SHG成像的膠原纖維面積進行分析。正常皮膚乳頭層膠原纖維稍纖細，網狀層膠原纖維粗大，但排列均稀疏（圖3a），纖維面密度較低（圖3b）。與正常皮膚比較，瘢痕部位乳頭層和網狀層膠原纖維面密度明顯增加（圖3a、3b）（P＜0.050，P＜0.050）。瘢痕周圍與正常皮膚比較，乳頭層和網狀層膠原纖維面密度分別增加了1.35倍和1.60倍（圖3a、3b），具有統計學意義（P＜0.050，P＜0.001）。這些結果表明，不管是瘢痕部位還是瘢痕周圍，乳頭層和網狀層水平面的膠原纖維均明顯增生。

2.3 液晶偏光影像技術研究燒燙傷瘢痕膠原纖維的病理變化

2.3.1 液晶偏光影像技術研究燒燙傷瘢痕膠原纖維排列的變化

液晶偏光影像技術不僅可以對具有雙折射特性的物質進行成像，對排列方向進行偽彩標注，將相同方向的雙折射信號按照同一顏色進行標注，同時可對雙折射物質的方向進行定量分析。膠原纖維具有雙折光性，所以液晶偏光影像技術可以對膠原纖維進行偽彩標注成像和分析。

為觀察正常皮膚、瘢痕和瘢痕周圍皮膚矢狀面膠原纖維的排列，我們通過液晶偏光影像技術對離體組織膠原纖維排列的方位角進行檢測。膠原纖維呈現的雙折射信號方位角的變異程度代表膠原纖維排列方向的特征，變異程度越小，說明膠原纖排列方向越一致，反之，說明呈隨機排列。正常皮膚乳頭層和網狀層膠原纖維均呈現多種顏色，膠原纖維方位角變異程度大（圖4a）。瘢痕部位乳頭層和網狀層膠原纖維顏色較少，呈平行排列，與正常皮膚比較，乳頭層和網狀層方位角變異程度均顯著降低（圖4a、4b）（P＜0.001，P＜0.010）。瘢痕周圍方位角與正常皮膚比較，其變異程度均顯著降低（圖4a、4b）（P＜0.010，P＜0.010）。這些結果表明瘢痕和瘢痕周圍乳頭層和網狀層矢狀面膠原纖維的排列方向變異程度降低，方向趨向一致。

2.3.2 液晶偏光影像技術研究燒燙傷瘢痕皮膚膠原纖維密度的變化

通過液晶偏光影像技術對離體組織矢狀面膠原纖維的相位差進行檢測，相位差值代表纖維組織雙折光信號的密度，相位差值越大代表膠原纖維密度越大，反之密度越小。正常皮膚乳頭層和網狀層排列稀疏，膠原纖維相位差值較小。瘢痕部位乳頭層和網狀層排列密集，膠原纖維相位差值增加，與正常皮膚比較，乳頭層相位差值增加，但沒有統計學意義（P＞0.050），網狀層相位差值顯著增加（P＜0.010）。與正常皮膚比較，瘢痕周圍乳頭層和網狀層排列均密集，膠原纖維相位差值均增加（P＜0.050，P＜0.010），具體結果詳見圖5。以上結果表明，瘢痕部位和瘢痕周圍乳頭層和網狀層矢狀面的膠原纖維明顯增生，這與人體燒燙傷瘢痕的特點一致。

圖2 SHG成像技術檢測乳頭層和網狀層膠原纖維排列的變化Fig.2 Arrangement of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by SHG imaging technology

圖3 SHG成像技術檢測乳頭層和網狀層膠原纖維面密度的變化Fig.3 Area density of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by SHG imaging technology

圖4 液晶偏光影像技術研究乳頭層和網狀層膠原纖維排列的變化Fig.4 Arrangement of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by liquid crystal polarized imaging technology

圖5 液晶偏光影像技術研究乳頭層和網狀層膠原纖維密度的變化Fig.5 Density of collagen fibers in papillary layer and reticular layer detected by liquid crystal polarized imaging technology

3 討論

瘢痕是各種創傷后所引起的正常皮膚組織的外觀形態和組織病理學改變的統稱［9］，創傷愈合后瘢痕的演變通常經歷增生期、消退期和成熟期，不同時期瘢痕內的病理狀態并非一致［10］。在嚙齒類動物的燒燙傷瘢痕中，大量研究設置6個月作為研究瘢痕最長的時間［11-13］，這個時間可能是嚙齒類動物瘢痕成熟期，所以本試驗選擇了6個月作為研究瘢痕的時間。

本試驗在檢測瘢痕部位膠原纖維病理變化的同時，還對瘢痕周圍組織進行了檢測，這是因為瘢痕周圍可以反映燒燙傷部位愈合且不留有瘢痕皮膚的膠原纖維是否正常。瘢痕部位沒有毛發生長，瘢痕周圍部位有毛發，但不易脫毛，脫毛后殘留毛根粗、長，而正常部位毛發容易脫毛，脫毛后殘留毛根細、短。本試驗的檢測需要對病理組織進行脫毛處理，所以容易辨別瘢痕周圍組織、瘢痕組織和正常組織。

在皮膚的真皮組織中，膠原纖維含量占70%～85%，是細胞外的主要成分。研究發現膠原纖維的排列和密度在皮膚的生物力學特性中發揮著重要作用［14］。正常皮膚膠原纖維呈網狀結構，膠原纖維面密度較小，這種結構特點維持了皮膚正常的彈性和拉伸強度，而在瘢痕組織中，膠原纖維的排列［15-17］和密度［18-21］均發生了改變。為進一步觀察真皮不同深度膠原纖維的病理變化，本試驗從真皮的分層著手研究，真皮分為乳頭層和網狀層［22］，乳頭層和網狀層在結構和功能等方面表現不同。乳頭層是緊鄰表皮的薄層結締組織，膠原纖維細密，乳頭層含有豐富的毛細血管和游離神經末梢，其主要作用是加強與表皮的連接，為表皮提供營養。網狀層是位于乳頭層下方的厚層結締組織，膠原纖維粗大，交織成網狀結構，其主要作用是為皮膚提供結構支撐和拉伸作用。本試驗從乳頭層和網狀層的角度，分別研究了燒燙傷小鼠瘢痕和瘢痕周圍膠原纖維的排列和密度，結果發現乳頭層和網狀層膠原纖維排列方向趨向一致，均與表皮平行，密度均增加，這些膠原纖維排列和密度的病理改變勢必影響皮膚正常的生物力學特性。

本試驗通過偏振光影像技術對離體膠原纖維進行了成像和定量檢測。傳統方法對離體組織膠原纖維的檢測主要是進行病理染色，但這種方法不能定量檢測膠原纖維的排列和密度。液晶偏光影像系統通過特有的液晶補償光學元件可以將偏振光波產生的光程差信號轉變為電信號，再通過軟件在監測器上還原成明暗不同的光信號。而且液晶偏光成像采用近似圓偏振光片，可彌補傳統線偏振光的不足，無論雙折射的物質取向如何，均可以對物質的方位角變異程度和密度定量分析。膠原纖維具有雙折光性，在離體組織經脫蠟后，不需任何染色條件下，液晶偏振光影像技術可以對膠原纖維檢測，并通過系統自帶軟件對方位角變異程度和密度進行定量分析［23-24］，而膠原纖維排列和密度的分析對于診斷瘢痕具有重要的意義。

雖然偏振光影像技術對膠原纖維的檢測擁有傳統方法不可比擬的優點，但無創、活體檢測才能反映出更多的生物醫學信息。SHG成像技術是新近發展起來的激光掃描非線性光學顯微術，以生物組織非中心對稱性的內源性信號為來源，不需進行染色，可以直接原位成像，而且采用近紅外的飛秒激光作為光源，對組織探測深、損傷小、分辨率高［25］。二次諧波成像技術不僅可以對活體組織x和y平面進行掃描，同時對z軸方向進行檢測，從而實現三維成像。膠原纖維具有強烈的二階非線性極化率和結構非中心對稱性，可以產生二次諧波。SHG成像技術可以活體、無創、定量研究膠原纖維的病理變化。目前SHG成像技術廣泛應用于藥物透皮［26］和癌變組織［27］，而且也逐漸應用到瘢痕膠原纖維的研究中［28-30］。本試驗通過SHG成像技術活體、無創檢測了燒燙傷小鼠瘢痕乳頭層和網狀層膠原纖維的病理變化，這為將來在人體無創和定量研究瘢痕提供了方法。

本試驗通過SHG和液晶偏振光影像技術從活體皮膚水平面和離體組織矢狀面檢測燒燙傷小鼠瘢痕膠原纖維排列方向和密度的變化，雖然SHG成像技術與液晶偏振光影像技術物理機制不同，但反映出來的意義相同，均可以反應膠原纖維排列和密度的病理變化。而且本試驗發現SHG和液晶偏振光影像技術對膠原纖維的檢測結果趨勢一致，即瘢痕部位、瘢痕周圍乳頭層和網狀層膠原纖維的排列方向均偏向一致，與表皮平行，膠原纖維密度明顯增加，這種結果趨勢的相同為僅通過SHG成像技術無創鑒別瘢痕組織提供了可能。總之，通過本研究希望建立一種活體、無創鑒別瘢痕組織的評估方法，為人體預防和治療瘢痕形成的藥物治療提供檢測方法。