超聲結合4,4-雙甲基姜黃素對DNA損傷的實驗研究

劉冰彌，張 闖，李 麗,3，劉洋成，欒佳思，劉 宇,3

(1.遼寧大學藥學院，遼寧沈陽110036；2.遼寧新藥研發重點實驗室，遼寧沈陽110036；3.遼寧省天然產物制藥工程技術研究中心，遼寧沈陽110036）

0 引 言

姜黃素(Curcumin)是從中國傳統中草藥的根莖中提取的一種成分，對多種腫瘤細胞具有抗增殖活性和誘導凋亡作用，在體內可抑制腫瘤發生，具有良好的臨床應用潛力[1]。為提高其體內抗癌活性，人們對姜黃素結構進行了大量的修飾和改造，出現了許多活性顯著的姜黃素類似物[2]，但是大多數類似物因體內血藥濃度過低或消除迅速而不能發揮治療作用[3]。聲動力療法(SonoDynamic Therapy,SDT)是近年興起的一種極具臨床應用前景的腫瘤治療新方法，利用腫瘤細胞和正常細胞在氧化還原平衡方面的差異，通過超聲波照射聲敏劑(聲敏藥物)產生協同作用，提高腫瘤細胞內的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平，導致細胞死亡[4-6]，這種協同作用產生的效果比單獨藥物作用更強。因而，使用更小劑量的聲敏藥物結合超聲波照射就能達到治療效果。針對大多數抗癌活性顯著的姜黃素類似物都存在體內血藥濃度低的缺點，設想從姜黃素類似物中篩選出聲敏劑，利用超聲與低濃度姜黃素類似物的協同作用達到抗腫瘤效果。

姜黃素、羥基乙酰化姜黃素、4,4-雙甲基姜黃素(dimethylcurcumin,DMCU)的分子結構如圖1所示。研究發現姜黃素及其衍生物羥基乙酰化姜黃素(見圖 1)均具有聲敏性[7-8]。我們合成的姜黃素類似物 4,4-雙甲基姜黃素[9]，其化學結構與姜黃素及羥基乙酰化姜黃素差異較小，因此推測DMCU具有聲敏性。先前的研究已經證實了DMCU可與小牛胸腺雙鏈DNA以溝槽結合模式形成穩定的復合物，且兩者的距離在 2～8 nm 范圍內[10]。研究表明，當 ROS與DNA之間的距離在1.5～9 nm范圍內時，可直接攻擊DNA，造成DNA損傷[11]。因而，認為超聲結合DMCU產生的 ROS可有效損傷 DNA，從而引起DNA構象發生變化。為了驗證上述推測，本文以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)作為檢測 DNA 分子構象變化的熒光探針，利用熒光光譜技術研究超聲波照射結合 DMCU對 DNA的損傷作用，從而為ROS的產生及其作用提供依據。另一方面，鑒于ROS 生成被認為是SDT的主要機制，本文在模擬人體生理條件下采用氧化-萃取分光光度法[12]檢測超聲過程中產生的ROS，并使用ROS清除劑鑒別ROS種類，從而對超聲作用條件下 DMCU損傷DNA的聲化學機制進行初步探討。

圖1 姜黃素、羥基乙酰化姜黃素、4,4-雙甲基姜黃素(DMCU)的分子結構Fig.1 The molecular structures of curcumin and hydroxyl- acetylated curcumin,and 4,4-dimethylcurcumin(DMCU)

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

KQ-500DE型數控超聲儀(昆山超聲儀器有限公司)，頻率為 40 kHz，功率為 200 W。UV-2550紫外可見分光光度計(Shimadzu Co.,日本)；F-7000熒光光譜儀(Hitachi High-Technologies Co.,日本)；AL204電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；PHS-3TC酸度計；微量進樣器。

脫氧核糖核酸(小牛胸腺 DNA，北京奧博星生物技術責任有限公司產品)儲備液濃度為7.5×10-5mol·L-1；DMCU(實驗室自制)儲備液濃度為2.5×10-3mol·L-1；三(羥甲基)氨基甲烷(Tris,AR,天津市博迪化工有限公司)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI,AR,上海浩然生物技術有限公司)濃度為 7.5×10-5mol·L-1；二苯卡巴肼(DPCI,AR,國藥集團化學試劑有限公司)儲備液濃度為1.0×10-2mol·L-1；抗壞血酸(Vc,AR,國藥集團化學試劑有限公司)；甘露醇(D-Mann,AR,天津博迪化工股份有限公司)；L-組氨酸(L-His,AR,天津市光復精細化工研究所)，三種清除劑的儲備液濃度均為5×10-2mol·L-1。實驗用水為二次蒸餾水，其余試劑均為市售分析純。實驗中所有超聲作用過程均避光操作，水溫均保持在35～37 ℃。

2.2 實驗方法

2.2.1 DMCU的降解及超聲時間的研究

將7個規格均為25 mL的容量瓶，編號為1～7號。先向每個容量瓶加入相同體積的DMCU儲備液，用緩沖液定容。將上述溶液分別轉移至規格為50 mL的錐形瓶中，封口后，超聲作用分別0、1、2、3、4、5、6 h。超聲作用結束后，測定紫外吸收光譜。

2.2.2 超聲波照射DMCU溶液產生ROS的測定

取6個規格均為50 mL的容量瓶，分別標為1～6號，依次向其中加入不同體積的DMCU儲備液，再加入同體積DPCI儲備液，用緩沖溶液定容。移取25 mL上述溶液至規格為50 mL的錐形瓶中，封口后超聲作用 3 h。剩余溶液避光保存。在超聲作用過程中每隔半小時將每個錐形瓶按順時針方向移位一次，消除因不同位點超聲強度略有差異導致的機械誤差。超聲作用結束后，用苯與四氯化碳的混合溶液(體積比1:1)對兩組溶液進行萃取，移取有機層溶液測定紫外吸收光譜。實驗重復3次。

2.2.3 超聲作用前后DMCU對DNA損傷程度比較

取6個規格均為25 mL的容量瓶，編號為a～f。向a、b、c、d中分別加入同體積的DMCU儲備液，再向c、d、e、f中加入同體積的DNA儲備液，用緩沖液定容。將 b、d、f中的溶液分別轉移至規格為50 mL的錐形瓶中，封口后超聲作用3 h，a、c、e瓶避光保存。超聲作用結束后，檢測a～f溶液的紫外吸收光譜。

另取4個規格均為25 mL的容量瓶，編號為g～j，分別加入同體積DNA儲備液，在g和h中加入同體積DMCU儲備液，然后向4個瓶中加入緩沖液，使得每瓶中的溶液體積均為20 mL。將j和h中的溶液轉移至規格為50 mL的錐形瓶中，封口超聲作用 3 h。另外兩瓶溶液避光保存。超聲作用結束后，分別向這4瓶溶液中加入DAPI儲備液。檢測a～d及g～j溶液在275 nm波長處激發的熒光光譜。

2.2.4 DMCU濃度對DNA損傷程度的影響

取7個規格為50 mL的容量瓶，編號為a～g。依次向其中加入不同體積 DMCU儲備液，再加入同體積DNA儲備液，最后加入緩沖液使每瓶中的溶液體積均為40 mL。分別移取上述溶液20 mL至規格為50 mL的錐形瓶，封口超聲作用3 h。在超聲作用過程中，每隔半小時將錐形瓶按順時針方向移動一次，以消除不同位點對超聲強度造成的誤差。剩余溶液避光保存。超聲作用結束之后，分別向這14份溶液中加入同體積的DAPI儲備液，檢測275 nm波長處激發的熒光光譜。

2.2.5 ROS的種類

選擇產生 ROS量最大的 DMCU濃度進行實驗。取4個50 mL容量瓶，先加入一定體積DPCI和DMCU儲備液，再向其中3瓶分別加入同體積的Vc、L-His和D-Mann儲備液，剩下一瓶溶液不加清除劑。超聲作用3 h后對所有溶液進行萃取，移取有機層溶液測定紫外吸收光譜。實驗重復3次。

3 結果與討論

3.1 DMCU的降解及超聲時間的確定

濃度為 1.5×10-5mol·L-1的 DMCU 溶液在不同超聲作用時間的紫外吸收光譜以及在波長 356 nm和 280 nm 處的吸光強度如圖 2(a)、2(b)所示。在200～550 nm波長范圍內，DMCU在波長 356 nm處出現了最強吸收峰。經超聲波照射后 DMCU發生了降解，在波長280 nm附近出現了新的吸收峰，可能是含有雙α,β-不飽和酮結構的DMCU分子降解生成了含單個 α,β-不飽和酮結構的化合物分子。根據圖 2(b)可獲得DMCU在這兩個波長處的吸收強度隨超聲作用時間變化曲線。如圖2(b)所示，隨著超聲波照射時間的增加，DMCU在波長356 nm處的吸收強度迅速下降，2 h后趨于穩定，表明DMCU已經完全降解；在波長280 nm處的吸收強度隨著超聲時間的增加而升高，3 h后吸收強度存在較明顯的波動。因此，將后續實驗中的超聲作用時間設定為3 h。

圖2 DMCU降解的吸收光譜以及DMCU在波長356 nm和280 nm處的吸光度隨超聲照射時間的變化Fig.2(a)Absorption spectra of DMCU degradation and(b)the absorbance changes of DMCU solution at 356 nm and 280 nm with different ultrasonic irradiation times

3.2 超聲作用條件下DMCU濃度與ROS的產量關系

氧化-萃取分光光度法是一種簡單有效的檢測ROS的方法，水溶性的DPCI可被ROS氧化成不溶于水的 1,5-二苯基卡巴腙(Diphenylcarbazone,DPCO)，通過有機溶劑萃取出的 DPCO在波長563 nm處，吸收光譜有最大吸收峰，且吸收強度與ROS的產量呈正相關性[12]。圖3(a)描述了超聲波照射不同濃度DMCU溶液的過程中生成的DPCO的吸收光譜圖。由圖 3(a)中可以看出，超聲照射 3 h的有機層溶液均在波長563 nm處有明顯的吸收峰，表明溶液中均產生了ROS。此外，單純超聲作用雖然也能使溶液中產生 ROS，但產量較低，加入DMCU后ROS明顯增多。圖3(b)中比較了超聲照射和未經超聲照射兩種情況下，不同濃度的DMCU溶液在波長 563 nm處的吸收值，DPCI濃度為1.0×10-3mol·L-1，超聲作用時間為 3 h，數據用三個實驗的平均值±標準差表示。如圖 3(b)所示，未經超聲照射的不同濃度的DMCU溶液在波長563 nm處的吸收值差別不大，但與超聲照射組相比差異明顯。另外，隨著DMCU濃度增大，ROS產量逐漸升高，當 DMCU 濃度為 1.5×10-5mol·L-1時，ROS產量達到最大，原因可能是當濃度高于1.5×10-5mol·L-1后，溶液中過多的 DMCU 阻滯了聲致發光的傳導，導致產生的ROS減少。

圖3(a)濃度為1.0×10-3mol·L-1的DPCI與不同濃度DMCU混合的溶液中產生的DPCO的吸收光譜；(b)在3小時超聲照射和無超聲照射下DPCO在563 nm處的吸光度變化Fig.3(a)Absorption spectra of the generated DPCO in the mixed solutions of DPCI(1.0 × 10-3mol·L-1)and DMCU(different concentrations)and(b)the absorbance changes of DPCO at 563 nm under 3 hours of ultrasonic irradiation or non-irradiation

3.3 超聲照射前后DMCU及DMCU+DNA溶液的吸收光譜

在 DNA溶液和 DMCU溶液濃度均為1.5×10-5mol·L-1，DNA、DMCU 及 DNA+DMCU溶液在超聲照射和無照射條件下的吸收光譜如圖 4所示。從圖4可知，單獨DNA溶液的特征吸收峰值在261 nm處，而DNA與DMCU混合液在波長261 nm處的吸收強度顯著提高，說明加入 DMCU后的 DNA溶液發生了明顯的增色效應，表明DMCU與DNA形成了復合物DNA-DMCU。超聲作用條件下單獨DNA溶液相較于無超聲照射的溶液表現出增色效應，表明DNA受到了損傷，其構型發生了變化。其原因可以解釋為超聲照射過程中溶液中產生了具有高氧化活性的ROS，它們在短時間內攻擊近旁的DNA分子，使得DNA分子的空間結構遭到破壞，雙螺旋結構展開，DNA的堿基對被暴露出來，導致其特征吸收峰處的吸收強度增大[13]。此外，由于DMCU的降解產物與DNA的吸收譜帶部分重疊，因而不能通過比較超聲前后DNA與DMCU混合溶液在波長261 nm處附近的吸收強度判斷DNA的受損程度。因此，我們借助熒光探針通過熒光光譜法來進行比較。

圖4 DNA、DMCU及DNA+DMCU溶液在3小時超聲照射和無照射條件下的吸收光譜Fig.4 Absorption spectra of DNA,DMCU and DNA+DMCU solutions under 3 hours of ultrasonic irradiation or nonirradiation

3.4 超聲照射前后DMCU存在下DNA損傷程度的對比

文獻[10]已經證實，在模擬生理條件下DMCU與DNA可形成復合物DNA-DMCU，且其可與DNA小溝結合的熒光探針DAPI發生競爭取代反應。在360 nm的激發波長下，DNA-DAPI復合物的最強發射峰出現在波長 460 nm 附近[14]，超聲前后的DMCU溶液在波長400～500 nm范圍內均有熒光，因而對復合物的熒光強度可產生干擾。當將激發波長設定為275 nm，DNA、DMCU、DAPI溶液濃度均為 1.5×10-5mol·L-1時，超聲波照射前后的 DNA與DMCU混合溶液c與d及單純DMCU溶液a與b的最強熒光發射峰均出現在波長350 nm附近，而DNA- DAPI復合物在波長463 nm處出現最強發射峰(見圖5)。因此，我們選擇275 nm作為激發波長，以消除其他物質對DNA-DAPI復合物熒光強度的影響。

由圖5可知，以DAPI作為熒光探針，超聲照射的DNA溶液j相較于無超聲照射的DNA溶液i在波長 463 nm處的熒光強度有所下降，表明單獨超聲波照射僅對DNA分子造成輕微損傷。此外，在無超聲照射條件下，先將DMCU加入到DNA溶液，然后再加入DAPI熒光探針，由此形成的混合溶液 g在波長 463 nm處的熒光強度明顯低于DNA+DAPI混合溶液i，表明在溶液g中，DMCU 先與DNA發生了相互作用，與一定量的DNA分子形成了幾乎無熒光的復合物 DNA-DMCU，后加入的DAPI與該復合物上DMCU發生競爭取代反應，將一部分 DMCU取代下來，同時形成強熒光的DNA-DAPI復合物。由于溶液i和g中DNA濃度相同，則g中與DAPI相結合的DNA分子數量少于 i中的 DNA分子數量，因而形成強熒光的DNA-DAPI復合物少于i溶液。然而，超聲照射后的DNA+DMCU混合溶液再加入DAPI熒光探針，由此形成的混合溶液h在波長463 nm附近的熒光強度比無超聲照射的混合溶液g更低。因此可以推測，除了DMCU結合造成的DNA損傷外，超聲結合DMCU產生的協同效應也對DNA產生了損傷。通過4種溶液體系在463 nm附近的熒光強度值可知，由溶液 g→h的熒光強度差值大于由溶液 i→g的差值，表明超聲結合 DMCU產生的協同效應可使DNA發生嚴重損傷，且效果比單獨使用超聲波照射或單獨使用DMCU更好。

3.5 DMCU濃度對DNA損傷程度的影響

為了進一步考察超聲條件下 DMCU濃度對DNA損傷的影響，以DAPI作為熒光探針通過熒光光譜比較了超聲照射(3 h)和無超聲照射條件下DNA的損傷程度，結果如圖6所示。實驗中，DNA和 DAPI的濃度均為 1.5×10-5mol·L-1。在無超聲波照射和超聲波照射(3 h)兩種條件下，在波長463 nm處的熒光強度都隨著 DMCU濃度升高而降低，表明隨著DMCU濃度的增加，DMCU與結合在DNA分子上的熒光探針 DAPI發生了競爭取代，致使DNA-DAPI復合物減少，從而導致熒光強度降低，但超聲照射組熒光強度降低的程度比未照射超聲組更大。以上結果表明，在一定時長的超聲波照射條件下，隨著DMCU濃度升高，ROS產量增多，因而有更大的幾率破壞 DNA分子，導致在波長463 nm處的熒光強度降低，為超聲結合DMCU協同產生的ROS對DNA造成了進一步損傷的結論提供了有力的證據支撐。

圖6 在3小時超聲照射和無照射條件下，以DAPI為探針的不同濃度DMCU與DNA混合溶液在463 nm處熒光強度對比Fig.6 Comparison of the fluorescence intensity at 463 nm of the mixed solution of DNA and DMCU(different concentrations)with DAPI as a probe under 3 hours of ultrasonic irradiation or non-irradiation

3.6 ROS種類的鑒別

為了鑒定ROS種類，本文選取Vc、L-His和D-Mann三種ROS清除劑進行研究。不同類型ROS清除劑對DPCO吸收值的影響如圖7(a)所示。

實驗中 DPCI濃度為 1.0×10-3mol·L-1，DMCU濃度為 1.5×10-5mol·L-1，D-mann、L-His、Vc 的濃度為2.0×10-3mol·L-1，作用時間為3 h。數據用3個實驗的平均值±標準差表示。?表示P＜0.05，與對照溶液(DMCU+DPCI+US)相比有顯著差異，NS表示D-Mann組與L-His組之間無顯著差異。Vc可以清除所有種類的ROS[15]；L-His是單線態氧(1O2)和羥基自由基(·OH)的清除劑[16]；而D-Man則只能清除溶液中的·OH[17]。

如圖7(a)所示，在加入Vc后，DPCO吸收值明顯降低，降低的程度與ROS清除劑對不同種類ROS清除的程度有關，因此可推測混合溶液中將 DPCI氧化為DPCO的物質主要為ROS。

根據圖7(b)，經計算可知，L-His與D-Man兩種清除劑對 DPCO的吸收值之比P﹥0.05。因此，二者對DPCO吸收值的影響并無顯著差別，表明超聲結合DMCU產生的ROS主要含有·OH。最近，香港中文大學的XU C S小組分別用1O2清除劑疊氮化鈉和·OH清除劑硫脲證實了經超聲波照射的姜黃素溶液中產生了1O2和·OH兩種類型的ROS[18]，與本實驗結果具有部分一致性。此外，有研究發現單純對脫氧水超聲產生的ROS類別主要為1O2，結合本實驗結果，我們認為·OH的產生與超聲介導DMCU的降解相關。

圖7(a)在3小時超聲照射和存在不同ROS清除劑的條件下DPCI-DMCU混合溶液產生的DPCO的吸收光譜；(b)不同ROS清除劑對563 nm處DPCO 的吸光度的影響Fig.7(a)Absorption spectra of the generated DPCO of DPCIDMCU mixed solutions in the presence of different ROS scavengers and 3 hours of ultrasonic irradiation and(b)the effects of the different ROS scavengers on the absorbance of DPCO at 563 nm

4 結 論

本文以DAPI為熒光探針，利用熒光光譜技術研究了 4,4-雙甲基姜黃素(DMCU)存在條件下超聲波照射對DNA的損傷，考察了藥物濃度對DNA損傷程度的影響，并對相關機制進行了初步探索。結果表明，超聲結合DMCU產生的協同效應對DNA損傷的程度比單純 DMCU和單純超聲都要大。聲化學機制研究表明，超聲與 DMCU協同作用過程中種類為羥基自由基的活性氧的產生與超聲介導DMCU的降解相關。本論文的研究結果一方面嘗試為天然活性產物的藥物化學研究結果開辟新的應用領域，另一方面希望為新型聲敏劑的篩選和開發提供理論依據和實踐基礎。