回顧性分析年齡與拮抗劑方案移植時機的相關性*

鄧星，韓艷，彭偉，段超群，李清，劉珍

（江西省宜春市婦幼保健院生殖科，宜春336000）

在體外受精-胚胎移植／卵胞漿內單精子注射(in vitro fertilization /intracytoplasmic sperm injection,IVF/ICSI） 治療過程中， 采用控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS）， 以獲得多個卵子同時發育，從而提高周期臨床妊娠率，但目前對控制性超促排卵方案的選擇尚無定論。 近年來拮抗劑（GnRH antagonist,GnRH-ant）方案因無提前的垂體抑制、用藥劑量少、用藥天數短、且無用藥初期的激發作用（flare-up）、更符合生理過程、降低卵巢過度刺激的綜合征（OHSS）的風險等越來越得到臨床的認可[1,2]。 但因拮抗劑方案對子宮內膜的影響一直存在爭論， 使得臨床對采用拮抗劑方案是否進行新鮮周期移植也沒有定論。 本研究對不同年齡段采用拮抗劑方案促排卵的患者新鮮周期與全胚冷凍后第一次復蘇移植妊娠結局的比較進行分析， 探討拮抗劑方案在不同年齡階段的新鮮移植策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2017 年7 月-2019 年12 月于我院生殖科行體外受精或卵胞漿內單精子注射（IVF/ICSI）治療患者的臨床數據。 納入標準：⑴夫妻雙方有IVF/ICSI 治療指征且無未控制的高血壓和糖尿病、無未診斷明確的心臟病、肝腎功能異常、 惡性腫瘤等病史可能影響患者的妊娠情況；⑵患者采用促排卵方案為拮抗劑方案，新鮮周期移植或全胚冷凍后第一次行FET；⑶全胚冷凍患者系因HCG 日孕酮≥2.5ng/ml 或預防卵巢過度刺激取消移植。排除標準：⑴患有甲狀腺疾病、子宮內膜異位癥或免疫性疾病等；⑵取消取卵周期或無可用胚胎者；⑶宮腔鏡檢查提示中重度宮腔粘連者。 最終納入274 例患者284 個周期。根據女方患者年齡分為2 組， A 組200 個周期（年齡＜40 歲），B 組84 個周期（年齡≥40 歲。 兩組又分為新鮮周期移植組，包括：A1 組127 個周期、B1 組73 個周期， 全胚冷凍后第一次凍融胚胎復蘇移植組， 包括A2 組62個周期、B2 組22 個周期，亞組間進行比較。

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案 采用拮抗劑靈活方案。 從月經第2-3 天根據患者竇卵泡數（antral follicle count，AFC）、基礎促卵泡生成素（basal follicle stimulating hormone，bFSH）水平及體重指數（body mass index，BMI）給予Gn(果納芬,默克雪蘭諾有限公司）150-300IU 開始促排卵， 注射3-4d 后行陰道B 超監測卵泡大小和血清雌二醇（estradiol，E2）、黃體生成激素（luteotropic hormone，LH）的水平，當卵泡直徑≥14 mm 時[3]，或者優勢卵泡直徑＞12mm 且血清E2＞300pg/ml 時開始使用加用GnRHA（思則凱,默克雪蘭諾有限公司）0.25 mg/d，間斷陰道B 超監測卵泡生長以及抽血查E2 和LH， 調整Gn 劑量和劑型，當有2 個卵泡直徑＞17mm 或者1 個卵泡直徑＞18mm 時，停止注射Gn， 當晚肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠醫藥，珠海）4000U 或者皮下注射艾澤(默克雪蘭諾有限公司)0.25mg，給予HCG注射后34-36h 取卵。

1.2.2 取卵、 胚胎移植和黃體支持 經陰道B 超引導進行取卵、體外受精和胚胎培養，新鮮周期移植為選擇1-3 個胚胎在取卵后72h 移植。 取卵當日開始肌肉注射黃體酮P（浙江仙琚制藥）40mg,每日1 次+地屈孕酮片(達芙通，雅培制藥) 20mg,口服，每日2 次給予黃體支持。

1.2.3 冷凍胚胎復蘇移植內膜準備和黃體支持 根據患者月經周期是否規則， 內膜準備方案采用自然周期或激素替代周期。 月經規則或既往監測有排卵者， 采取自然周期，B 超監測卵泡發育排卵后3d 行胚胎解凍復蘇移植并給予地屈孕酮片20mg,口服，每日2 次黃體支持；月經周期不規則、無排卵或排卵障礙者，月經第l-2 天開始口服戊酸雌二醇（補佳樂，拜耳醫藥），3mg,每日2 次，連續口服12-14d 并做陰道超聲監測，當子宮內膜≥8mm 且血E2≥200pg/ml 時肌肉注射黃體酮40mg, 每日1次+地屈孕酮片20mg,口服，每日2 次進行內膜轉化為分泌期，并于轉化后3d 行胚胎解凍復蘇并移植，繼續給予黃體酮注射液、地屈孕酮及戊酸雌二醇作為黃體支持。

1.2.4 胚胎質量評分法 取卵后48/72h 根據胚胎發育速度和形態給胚胎進評分: ⑴1 級胚胎(Ⅰ)：細胞數目正常，卵裂球致密、大小正常、對稱性好、≤5%碎片。 ⑵2 級胚胎(Ⅱ)：①細胞數正常(7-9 細胞)，無碎片，任一指標欠佳（包括細胞大小、卵裂球致密性、對稱性）；及各指標正常，有≤25%的碎片。⑶3 級胚胎(Ⅲ)：①無碎片，細胞大小、細胞數、卵裂球致密性、對稱性中有二項指標欠佳，或任一指標異常、有大于25%的碎片；②有25%-50%的碎片；③受精第二天為二細胞； 第三天為四細胞及以下Ⅲ級起評。⑷4 級胚胎(Ⅳ)：①碎片率小于25%、細胞大小、卵裂球致密性、細胞數及對稱性等多項指標異常；②大于50%碎片。 D3 優質胚胎選取標準：取卵3d 后可觀察為I 級或II 級胚胎。

1.3 妊娠判斷 生化妊娠的判斷為移植后14d 血清β—hCG＞50mIU/ml，臨床妊娠指的是移植后28d B 超檢查見孕囊，而流產為妊娠不足28 周、胎兒體重不足1000g 而終止妊娠者。

1.4 統計學方法 數據統計分析應用SPSS21.0 進行。 計數資料用百分率（%）表示，組間比較用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗； 計量資料用均數±標準差（±s）表示，比較用t 檢驗。P＜0.05 時差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況分析 共納入217 周期患者A 組200 個周期（年齡＜40 歲），B 組84 個周期（年齡≥40 歲。 新鮮周期移植組， 包括A1 組127 個周期、B1 組73 個周期，全胚冷凍后第一次凍融胚胎復蘇移植組,包括A2 組62 個周期、B2 組22 個周期,亞組間進行比較,兩亞組間患者平均年齡、體重指數、bFSH/bLH、AMH 無統計學差異（見表1，表2）。

表1 A 組患者一般情況比較（±s）

表1 A 組患者一般情況比較（±s）

A1 A2 t P周期數年齡（歲）不孕年限（年）BMI(kg/m2)bFSH/bLH hCG 日E2（pg/ml）AMH(ng/ml)127 33.0±4.5 4.1±3.8 21.9±2.8 2.1±1.0 2066.5±1259.3 2.7±3.0 62 33.0±4.6 4.4±3.0 22.2±2.5 2.0±0.9-0.080-0.578-0.866 0.782 0.936 0.564 0.387 0.435 3.7±3.4-1.867 0.064

表2 B 組患者一般情況比較（±s）

表2 B 組患者一般情況比較（±s）

B1 B2 t P周期數年齡（歲）不孕年限（年）BMI(kg/m2)bFSH/bLH hCG 日E2（pg/ml）AMH(ng/ml)73 42.5±2.0 3.1±3.0 22.8±2.6 2.6±1.3 1880.8±1320.2 1.6±1.7 22 42.8±2.6 4.5±3.6 22.9±2.4 2.4±1.0-0.686-1.756-0.075 0.823 0.495 0.082 0.940 0.412 2.3±3.1-1.047 0.305

2.2 促排卵周期資料分析 亞組間比較Gn 總量、Gn 天數（天）、獲卵數、受精率、成熟卵率、D3 天優胚率、移植胚胎數、原繼發不孕構成比、受精方式構成比、至少移植1 枚優胚構成比、內膜厚度均無統計學意義（見表3，表4）。

2.3 臨床結局 ＜40 歲組患者新鮮胚胎移植后的生化妊娠率、 臨床妊娠率及種植率均低于全胚冷凍后第一次移植組，有統計學意義（見表5）,而≥40歲患者行新鮮和全胚冷凍后第一次移植的生化妊娠率、臨床妊娠率及種植率未見明顯差異(見表6)。

表3 A 組促排卵情況（±s）

表3 A 組促排卵情況（±s）

A1 A2 t 或χ2 P Gn 總量（IU）Gn 天數（天）獲卵數（個）成熟卵率（%）受精率（%）D3 優胚率（%）移植胚胎數（個）不孕類型(繼發)（%）受精方式(IVF/ICSI)至少移植一枚優胚（%）內膜厚度(mm)2000.5±489.6 9.0±1.6 8.7±5.2 89.8±14.7 83.0±8.7 37.9±27.0 1.9±0.5 81.1(103/127)114/13 82.7(105/127)10.3±2.1 2107.2±621.6 9.3±1.9 10.0±5.8 87.8±13.0 81.4±15.1 41.2±20.3 2.0±0.4 85.5(53/62)54/8 88.7(55/62)9.8±2.1-1.285-1.233-1.517 0.921 0.575-0.932-0.534 0.555 0.300 1.167 1.562 0.201 0.219 0.131 0.358 0.566 0.353 0.594 0.456 0.584 0.280 0.120

表4 B 組促排卵情況（±s）

表4 B 組促排卵情況（±s）

B1 B2 t 或χ2 P Gn 總量（IU）Gn 天數（天）獲卵數（個）成熟卵率（%）受精率（%）D3 優胚率（%）移植胚胎數（個）不孕類型(繼發)（%）受精方式(IVF/ICSI)至少移植一枚優胚（%）內膜厚度(mm)2176.0±718.2 8.8±2.4 5.9±4.3 88.7±16.1 82.3±20.5 43.9±29.7 2.0±0.6 98.6(72/73)68/5 79.5(58/73)10.0±2.1 2050.0±665.0 8.7±1.6 6.9±4.4 91.6±11.7 87.9±13.8 52.4±22.9 2.0±0.7 100.0(22/22)20/2 72.7(16/22)9.3±2.4 0.733 0.147-0.930-0.762-1.197-1.237-0.118 0.124 0.444 1.276 0.465 0.883 0.355 0.448 0.234 0.219 0.906 1.000 0.724 0.505 0.205

表5 A 組臨床結局

表6 B 組臨床結局

3 討論

GnRH 拮抗劑方案無需經過促排卵前的垂體降調節過程， 與GnRH 激動劑方案相比具有刺激更溫和、用時更短等多方面優勢[4]。 近年來，拮抗劑方案在IVF/ICSI 促排卵治療中應用越來越多見。但是也有很多文章報道認為采用拮抗劑方案新鮮周期移植的臨床妊娠率較GnRH 激動劑方案的臨床妊娠率低[5,6]，而兩種方案后冷凍胚胎復蘇移植妊娠率無明顯差異[7]。 我們現在許多中心在采用拮抗劑方案促排卵后進行全胚冷凍， 但是這使得拮抗劑方案的治療周期大大加長， 因此探討拮抗劑方案新鮮移植的選擇策略顯得尤為重要。 而無論是自然妊娠或是通過輔助生殖技術， 女性年齡都是決定能否成功妊娠的最重要因素[8-10]。

本文通過將患者＜40 歲與≥40 歲進行新鮮胚胎移植與全胚冷凍后第一次移植后的臨床結局進行比較發現，＜40 歲組患者新鮮胚胎移植后的生化妊娠率、 臨床妊娠率及種植率均低于全胚冷凍后移植組， 而≥40 歲患者行新鮮和全胚冷凍后第一次移植的生化妊娠率、 臨床妊娠率及種植率未見明顯差異。 Ming-Chao Huang 等[11]通過比較不同年齡組卵巢儲備功能低下患者采用GnRH 拮抗劑和激動劑方案也發現，≤35 歲患者采用拮抗劑方案后移植胚胎種植率低，與本研究一致。 IVF 治療中的采用不同的促排卵方案與子宮內膜容受性變化有關系[12,13]，有研究認為拮抗劑方案可能促使子宮內膜間質細胞HOXA10 表達下降[14]，從而導致子宮內膜容受性改變。 Siraypiwat 等[15]研究結果顯示，有正常排卵的婦女，在卵泡期注射GnRHA 后種植窗口期子宮內膜容受性的標志物同源框基因10（HOXA10）蛋白表達沒有明顯影響。 但是，我們的數據顯示在不同年齡組患者采用拮抗劑新鮮移植和全胚冷凍后復蘇移植后的臨床結局不一樣，Ming-Chao Huang 等也研究認為子宮內膜容受性受年齡的影響應該較小。 我們也知道成功妊娠還需要胚胎與子宮內膜的同步性。 拮抗劑方案可能導致子宮內膜提前成熟，干擾了胚胎種植窗[16]。 胚胎與子宮的同步性是受COS 方案調節的， 一些研究表明， 超生理水平的雌激素不利于新鮮周期的妊娠[17,18]。 但目前關于年齡在新鮮周期移植與冷凍胚胎移植后臨床結局相關性的研究相對少見。Ange Wang 等[19]對新鮮移植與冷凍胚胎移植的種植率和持續妊娠率比較認為>35 歲患者冷凍胚胎移植似乎更有利，與本文數據不一致，但是文中指出HCG 日孕酮>1.0ng/ml 時，>35 歲組冷凍胚胎移植更為有利，這個差別有可能是因為HCG 日孕酮升高影響了新鮮周期的臨床結局。 目前我們的結果顯示不同的年齡新鮮移植存在臨床妊娠率的差異性，但機制不明，我們推測可能與≥40 歲新鮮周期卵泡數少、HCG 日E2 較年輕患者更低， 對子宮內膜容受性的影響更小有關， 但我們現數據尚不能支持HCG 日E2 水平是影響子宮內膜容受性的唯一因素，這需要進行進一步的機制研究。

綜上所述，＜40 歲患者采用拮抗劑方案建議考慮行全胚冷凍后復蘇移植， 而≥40 歲患者可以考慮新鮮胚胎移植。 我科方案選擇傾向于年輕、卵巢儲備功能好的患者選擇GnRH 激動劑方案，高齡、卵巢儲備功能低下和部分高反應的患者選擇拮抗劑方案。 因此，本研究中納入研究對象存在偏倚，需要擴大樣本量、設計更為合理的進一步研究。