REDD1 介導PI3K/AKT 通路調控乳腺癌細胞凋亡*

張衛瑋，李芬，鐘幸

(1.江西衛生職業學院，南昌330052；2.江西省腫瘤醫院淋巴血液科，南昌330029；3.江西省惠民醫院，南昌330046)

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤， 其死亡率占女性癌癥相關死亡率的第二位,晚期乳腺癌預后較差，臨床上迫切需要尋找新的治療靶點[1-3]。DNA 損傷反應調節基因1 (regulated in DNA damage and development1，REDD1) 在正常組織中REDD1 低表達，而當組織缺氧、細胞應激、DNA 損傷可誘導REDD1 高表達[4]。 研究表明，REDD1 是一種新的癌基因，與腫瘤發生、發展、放化療敏感性密切相關,抑制REDD1 表達可促進中卵巢癌、腎癌、頭頸部鱗癌等細胞凋亡、抑制細胞增殖，然而其在乳腺癌中的作用及機制尚不明確[5-7]。 磷脂酞肌醇3 激酶(PI3K)在腫瘤細胞調節中起著重要作用[8,9]。 REDD1 是PI3K/AKT 通路的重要調控蛋白，REDD1 可磷酸化激活PI3K/AKT 通路， 抑制細胞凋亡、促進細胞增殖，幫助腫瘤細胞在不良環境中存活[10,11]。 本研究擬從REDD1 介導PI3K/AKT 通路調控乳腺癌細胞凋亡的角度，闡述REDD1 在乳腺癌中的生物學功能及機制，為乳腺癌提供潛在的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料和組織標本 收集2017 年1 月-2018 年1 月江西省腫瘤醫院粗針穿刺活檢診斷為浸潤性乳腺癌患者的術后新鮮標本30 例（乳腺癌腫瘤組織及其相應的癌旁正常組織），檢測其組織中REDD1 蛋白、mRNA 表達水平。 本研究的倫理批準由江西腫瘤醫院倫理委員會提供。

1.1.2 細胞及主要試劑 人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231 細胞由江西省腫瘤轉化醫學重點實驗室提供。 DMEM 細胞培養基、胎牛血清等購自ThermoFisher 公司。 兔抗人REDD1 單克隆抗體、 兔抗人PI3K 單克隆抗體、 兔抗人AKT 及pAKT 單克隆抗體、 兔抗人Caspase3 單克隆抗體、兔抗人Bcl-xl 抗體、 兔抗人β-actin 及HRP 偶聯的抗兔IgG 二抗均購自CellSignaling 公司。 RNA提取及RT-qPCR 試劑盒購自ThermoFisher 公司。siRNA 及Hiperfect 轉染試劑購自ThermoFisher 公司。 Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒購自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人乳腺癌細胞株MCF-7 和MDA-MB-231 細胞培養液為含10%胎牛血清的DMEM, 于37℃含5%CO2的飽和濕度細胞培養箱中培養。 待細胞生長覆蓋70%-80%瓶底面積時，用于實驗操作或傳代。

1.2.2 siRNA 轉染 將MCF-7 和MDA-MB-231 細胞按5×104/孔的密度分別接種于6 孔板中，待細胞融合度為30%-50%時， 使用Hiperfect 轉染試劑，分別轉染siRNA- REDD1/NC， 放入細胞培養箱培養48h，進行后續實驗操作。

1.2.3 Western-blot 提取各處理組蛋白，等量蛋白樣品經SDS-PAGE 電泳后， 穩流將蛋白轉至甲醇預處理的PVDF 膜上，轉膜、封閉后按流程分別加入一抗(1:1000) 和二抗(1:5000)。 于MYECL Imager系統曝光。

1.2.4 RNA 提取和逆轉錄-定量PCR (RT-qPCR)總RNA 提取使用TRIzol， 逆轉錄及擴增反應采用RT-qPCR 試劑盒（SYBR Green）。 逆轉錄(20μl 體系)：42℃1h, 95℃10min。 qPCR (10μl 體系)：95℃3min，95℃15s，60℃30s，再循環擴增39 次。 基因相對表達水平采用2-ΔΔCq 計算方法。 引物序列如下:

1.2.5 細胞凋亡檢測 取對數生長期各處理組細胞制成單細胞懸液，Cell Staining Buffer 洗2 次，加入100μl Binding Buffer、5μl Annexin V-FITC、10ul PI, 室溫避光30min， 檢測前加入400μl Binding Buffer，1h 內上機檢測細胞凋亡。 每組設3 孔平行樣。 使用FlowJo 軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 REDD1 在乳腺癌組織中高表達 在25 對乳腺癌及其癌旁組織，RT-qPCR 結果提示REDD1 mRNA 在乳腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織(圖1A)。 在5 對乳腺癌（T）及其癌旁正常組織（N），Western-blot 結果顯示REDD1 蛋白在乳腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁正常組織(圖1B)。

圖1 REDD1 在乳腺癌組織中過表達。（A）RT-qPCR 檢測25 例乳腺癌組織及其癌旁正常組織中REDD1 mRNA 表達水平。（B）Western-blot 檢測5 例乳腺癌組織及其癌旁正常組織中REDD1蛋白表達水平

2.2 siRNA-REDD1 成功下調REDD1 表達水平為了進一步探索REDD1 生物學功能， 我們使用siRNA-REDD1/NC 轉染MCF-7 和MDA-MB-231細胞，siRNA-REDD1 成功下調REDD1 蛋白及mRNA 表達水平(圖2A&B)。

圖 2 MCF-7 和 MDA-MB-231 細 胞 分 別 轉 染siRNA-REDD1/NC。（A）RT-qPCR 檢測轉染后REDD1 mRNA表達水平（B）Western-blot 檢測轉染后REDD1 蛋白表達水平

2.3 下調REDD1 促進乳腺癌細胞凋亡 使用siRNA-REDD1/NC 分別轉染MCF-7 和MDA-MB-231 細胞后， 流式AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率（±s）。 結果顯示(圖3A)，MCF-7 細胞中對照組（REDD1-NC）凋亡率為(16.5±5.08)%，而REDD1 下調組凋亡率明顯升高，為(29±2.08)%；同樣，在MDA-MB-231 細胞中，對照組凋亡率為(17.4±1.38)%，而REDD1 下調組凋亡率(36.7±1.25)%。同時，我們檢測了凋亡蛋白cleaved caspase3(斷裂caspase3)和凋亡抑制蛋白Bcl-xl 表達水平，結果顯示（圖3B），REDD1 下調組抗凋亡蛋白BCL-xl 下降，cleaved-capase3 上升。

圖 3 MCF-7 和 MDA-MB-231 細 胞 分 別 轉 染siRNA-REDD1/NC。（A）AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測各組細胞凋亡率。（B）Western-blot 檢測MCF-7 細胞中凋亡相關蛋白cleaved-caspase3 和BCL-xl

2.4 下調REDD1 抑制PI3K/AKT 通路蛋白表達水平 為了探討下調REDD1 促進細胞凋亡的分子作用機制，使用siRNA-REDD1/NC 轉染MCF-7 細胞后行western-blot 檢測PI3K、AKT、pAKT 蛋白表達水平。結果顯示，siREDD1 組PI3K、pAKT 蛋白表達水平低于NC 組，AKT 蛋白表達無差異。 提示下調REDD1 可抑制PI3K/AKT 通路磷酸化激活(圖4)。

圖4 MCF-7 細胞轉染siRNA-REDD1/NC，Western-blot檢測凋亡相關蛋白PI3K/AKT 通路蛋白表達

3 討論

DNA 損傷反應調節基因1 ( regulated in DNA damage and development 1，REDD1 )是Shoshani 等在研究神經膠質瘤細胞乏氧時發現的、 因細胞缺氧誘導表達的一種基因。 在人體正常組織中，REDD1 廣泛低表達， 然而在腫瘤組織中，REDD1常呈現高表達，REDD1 高表達有助于幫助腫瘤細胞在組織乏氧、能量壓力、DNA 損害等的不良環境中存活[12]。 然而，REDD1 在腫瘤中可兼具抑癌、促癌功能， 表現在不同腫瘤、 不同環境中的功能不同。 研究表明REDD1 過表達可介導PI3K/AKT 促進前列腺細胞凋亡抵抗[10]，而另有研究卻顯示乏氧狀態可誘導REDD1 高表達、抑制mTOR，抑制前列腺癌細胞增殖[13]。 在卵巢癌中，REDD1 是ras 介導的人卵巢上皮是細胞癌變轉化的重要因子，REDD1 高表達可促進卵巢上皮細胞增殖、 抑制細胞凋亡[12,14]。 沉默REDD1 可抑制細胞自噬提高膀胱癌化療敏感性[15]。 然而，在乳腺癌中的作用及機制尚不明確。

本研究首先檢測了乳腺癌組織及癌旁組織中REDD1 表達水平，發現乳腺癌組織中REED1 在基因及蛋白水平上均明顯高于癌旁正常組織， 提示REDD1 在乳腺癌中的作用可能為癌基因, 與孫麗麗等在卵巢癌中的研究結果一致[16]。進一步功能學研究顯示，使用siRNA 下調REDD1 表達后，乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 細胞凋亡率明顯升高，凋亡蛋白cleaved-caspase3 升高，而凋亡抑制蛋白Bcl-xl 下降，抑制REDD1 表達可促進乳腺癌細胞凋亡，提示REDD1 可能參與調控乳腺癌細胞凋亡途徑。 然而，本研究未構建REDD1 過表達模型，具有一定的局限性，后續研究將進一步完善。

在乳腺癌中，P13K/AKT 信號通路激活與腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、轉移等惡性表型密切相關。癌基因過表達或抑癌基因突變均可上調PI3K/AKT通路表達，促進乳腺癌細胞惡性表型[17-20]，PI3K 抑制劑LY294002 可顯著性下調PI3K/AKT 通路從而抑制乳腺癌生長[21-23]。 本研究結果顯示,下調RED D1 表達可抑制PI3K/AKT 通路磷酸化激活， 促進乳腺癌細胞凋亡， 說明REDD1/PI3K/AKT 是調控乳腺癌細胞凋亡途徑的通路之一，但PI3K/AKT 通路是否為REDD1 主要的分子調控通路，還需要進行阻斷-恢復實驗進一步論證。

綜上，REDD1 在乳腺癌中高表達， REDD1 介導PI3K/AKT 通路調控乳腺癌細胞凋亡途徑，REDD1 可能為乳腺癌潛在新的靶基因。