HPLC法測定3-硝基芐叉基乙酰乙酸乙酯中的有關物質

劉云峰，李 正，孫 晨

(江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212009)

尼群地平為二氫吡啶類藥物，化學名為2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-1,4-二氫-3,5-吡啶二甲酸甲酯乙酯，為鈣通道阻滯劑，臨床上主治原發(fā)性高血壓、繼發(fā)性高血壓及冠心病[1]。其合成路線為兩步合成反應，起始原料以間硝基苯甲醛與乙酰乙酸乙酯進行Knoevenagel縮合反應得到3-硝基芐叉基乙酰乙酸乙酯(即尼群地平中間體產物A，簡稱尼A，下同)，尼A再與β-氨基巴豆酸甲酯進行分子內環(huán)合反應得到尼群地平產品[2]。尼A的質量好壞直接關系到最終產品的純度，尼A在合成過程中可能會引入起始物料間硝基苯甲醛雜質及產生少量的尼A異構體，為控制尼群地平中間體尼A的質量，我們參考相關文獻[3-5]，采用HPLC法控制尼A的有關物質，獲得了較理想的效果。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，2998PDA檢測器；Agilent 1220型高效液相色譜儀一體機；Sartorius SQP Quintix型電子天平。

1.2 試藥

間硝基苯甲醛對照品，批號：PCL_#_Ni070，含量99.91%，PCL公司；尼A，批號：20170701，20170702，20170703，江蘇吉貝爾股份有限公司生產；尼A異構體，批號：20170601，江蘇吉貝爾股份有限公司生產；乙腈，批號：JA048930，色譜純，Merck公司；四氫呋喃，批號：17020365，色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-四氫呋喃-水(20:24:56)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：271 nm；柱溫：30℃。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗

2.2.1 間硝基苯甲醛定位溶液的配制

精密稱取間硝基苯甲醛對照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成10 μg·mL-1的溶液。

2.2.2 尼A異構體定位溶液的配制

精密稱取尼A異構體適量，加乙腈溶解并稀釋制成10 μg·mL-1的溶液。

2.2.3 尼A定位溶液的配制

精密稱取尼A適量，加乙腈溶解并稀釋制成10 μg·mL-1的溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液的配制

精密稱取尼A約10 mg至100 mL容量瓶內，分別加入間硝基苯甲醛、尼A異構體定位溶液5、10 mL，加乙腈適量，超聲使溶解，用乙腈定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 色譜圖

在2.1項下色譜條件，采用PDA檢測器，分別量取空白溶劑、各已知物質定位溶液、系統(tǒng)適用性溶液各20 μL，注入液相色譜儀。結果顯示，尼A與可能存在的雜質在波長271 nm附近處有最大吸收，理論塔板數以尼A峰計為11239，尼A與間硝基苯甲醛的分離度為9.8，尼A與尼A異構體的分離度為8.1，尼A與間硝基苯甲醛及尼A異構體均能完全分離，且尼A的峰純度很好，其他雜質無干擾，色譜圖見圖1～3。

圖1 空白溶劑

圖2 系統(tǒng)適用性溶液 出峰順序依次為間硝基苯甲醛、尼A、尼A異構體

圖3 尼A樣品溶液

2.3 強制降解試驗

將尼A分別進行了酸、堿、氧化、強光破壞試驗，取強制降解后的樣品適量，加乙腈溶解并稀釋制成100μg·mL-1的溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液于2.1項下色譜條件中測定。結果顯示，尼A在酸、堿、氧化、強光條件下，都不同程度地發(fā)生了降解，其中以強光造成的破壞力最強，酸、堿條件亦能破壞產生新的未知單雜，氧化破壞力最弱，各降解產物均能與尼A達到良好分離，色譜圖見圖4～7。

圖4 酸破壞樣品

圖6 氧化破壞樣品

圖7 強光破壞樣品

2.4 線性

尼A、尼A異構體、間硝基苯甲醛在10μg·mL-1～200μg·mL-1范圍內的線性方程分別為A=117734.8C+1036.15；A=106299.95C-1250.95；A=38182.13C-974.13；相關系數(R2)分別為0.9998、0.9999、0.9999。尼A異構體、間硝基苯甲醛相對于尼A的校正因子分別為1.1、3.1。

2.5 檢測限和定量限

將線性中10 μg·mL-1的溶液繼續(xù)用乙腈稀釋，依法進樣，按信噪比S/N=3計算，尼A、尼A異構體、間硝基苯甲醛的檢測限分別為0.6、0.6、1.0 ng；按信噪比S/N=10計算，尼A、尼A異構體、間硝基苯甲醛的定量限分別為2、2、2 ng。

2.6 精密度試驗

兩人平行配制尼A樣品溶液和1%自身對照溶液，每人分別配制6份，分別進行重復性試驗與中間精密度試驗。重復性試驗中，6份樣品總雜平均含量均低于1.0%，6份樣品總雜含量的RSD為1.63%；中間精密度試驗中，6份樣品總雜平均含量均低于1.0%，6份樣品總雜含量的RSD為1.75%。經過兩組試驗考察，尼A有關物質檢測方法精密度良好。

2.7 準確度

準確度在雜質限度溶液濃度的80%、100%、120%三個水平考察，每個濃度平行配制3份供試品溶液。間硝基苯甲醛回收率在95.83%～99.16%之間；尼A異構體回收率在99.67%～104.23%之間。間硝基苯甲醛、尼A異構體的9個回收率數據的RSD分別為1.53%、1.76%。

2.8 溶液的穩(wěn)定性試驗

配制尼A樣品溶液和1%自身對照溶液，在室溫下分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣測定，考察各時間點雜質的增長情況。在12 h內，1%自身對照溶液主峰面積RSD為0.91%，因此1%自身對照溶液在12 h內是穩(wěn)定的。供試品溶液中，尼A在12 h內異構體的峰面積在緩緩增長，通過計算，表明供試品溶液在避光條件8 h內是基本穩(wěn)定的，超過8 h后樣品應另行現配，更能如實反映尼群地平中間體的品質與質量。

2.9 耐用性

配制系統(tǒng)適用性溶液，通過適當改變柱溫、流速、有機相比例、色譜柱品牌來評估，發(fā)現尼A有關物質檢測方法耐用性良好，適當小范圍改動參數后，出峰時間雖有變化，但尼A與間硝基苯甲醛及尼A異構體分離度依舊很好，能達到完全分離，方法耐用性良好。

2.10 樣品測定

按2.1項下色譜條件，對三批尼A進行了檢測，結果見表1。

表1 尼A有關物質測定結果

結論：三批尼A樣品中，檢測出少量的尼A異構體，未檢出間硝基苯甲醛，單雜均小于規(guī)定限度1.0%，總雜均小于規(guī)定限度2.0%，符合要求。

3 討論

本次試驗參考中華人民共和國藥典2015 年版( 二部)尼群地平有關物質檢測方法進行試驗。試驗過程中，發(fā)現樣品配制稀釋液若含有水，會導致樣品水解，不利于檢測，所以在試驗中稍作改變，將乙腈作為本次試驗的稀釋液，并取得了理想效果。強制降解過程中，發(fā)現樣品易受光照影響，所以樣品配制及檢測均需避光操作。通過溶液的穩(wěn)定性試驗發(fā)現，樣品最好在配制完成后8小時內進樣，在今后生產過程中完全可以做到對中間體實時監(jiān)控。采用高效液相色譜法測定尼A的有關物質，實驗方法準確，可靠，專屬性強，可用于尼群地平中間體產物的質量控制。