HPLC法建立腎茶醇提液中熊果酸檢測方法及其方法學驗證

黃天卓，丁薇娜，張琳杰，鄭浩然，何鑫磊

(美倫醫藥集團有限公司，天津 300403)

腎茶(Clerodendranthus spicatus (Thunb.) C. Y. Wu)又稱貓須草、貓須公、腎草，是唇形科，腎茶屬多年生草本植物。腎茶具有抗炎鎮痛、抗菌、抗氧化、利尿的作用，其還對肝臟腎臟有一定的保護作用[1]。臨床上腎茶常在國內被用來治療慢性腎炎、膀胱炎、尿路結石等，在國外也被用來治療糖尿病、高血壓，其含有黃酮類、酚酸類、木脂素類、二萜類、三萜類、色原烯類、甾體類、糖苷類和香豆素類等，其中熊果酸具有良好的抗炎作用[2]。近年來的研究發現熊果酸還具有抗癌的效果，因此其商業價值非常高[3]。腎茶提取物中化學成分復雜，目前很多熊果酸的HPLC檢測方法測得的腎茶醇提液中熊果酸的峰形并不符合《中國藥典》的要求，為了進一步利用腎茶提取物開發藥物制劑及建立質量標準，美倫醫藥集團有限公司研發部利用HPLC法建立了能較好分離腎茶提取物中熊果酸的分析方法并對其進行了方法學考察研究。

1 實驗儀器與試劑

1.1 儀器

1.2 試劑

乙腈186340(ThermoFisher Scientific)、娃哈哈礦泉水20181003(沈陽娃哈哈飲料有限公司)、磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)、四氫呋喃20181201(天津市大茂化學試劑廠)、熊果酸對照品110742-201915(中國藥品檢定研究院)、腎茶醇提液(美倫醫藥研發部提供)。

2 實驗方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品的制備

由美倫醫藥集團有限公司藥品研究院提供。

2.1.2 對照品的制備

精密稱量熊果酸對照品2.90 mg(94.7%)，用10 mL甲醇溶解，定容到10 mL容量瓶中即得274.63 μg/mL熊果酸對照溶液。

2.1.3 流動相的制備

乙腈∶0.45 μm過濾后超聲30 min、0.1%磷酸：取1 mL磷酸加入到1 L水中混勻，0.45 μm過濾后超聲30 min、5%四氫呋喃∶取50 mL四氫呋喃加入到1 L水中，0.45 μm過濾后超聲30 min、5%四氫呋喃(0.1%磷酸)∶取50 mL四氫呋喃加入到1 L 0.1%磷酸水中，0.45 μm過濾后超聲30 min。

2.2 色譜條件

2.2.1 檢測波長考察

寬甸縣年最高氣溫整體呈周期性變化如圖2所示。1989—1997年為一個變化周期，2000年最高氣溫為36.5℃，為歷史最高；2006年最高氣溫為30.7℃，為歷史最低；兩者相差5.8℃。2009—2013年最高氣溫逐年降低，2015年最低氣溫為一個極低值，2016年最高氣溫開始回升。

液相設置波長范圍為190～400 nm，對熊果酸全波長吸收檢測，記錄圖譜。從圖1可以看出熊果酸最大吸收波長在200 nm左右，固設置190、203、210 nm波長進行試驗，圖2、圖3、圖4顯示203 nm波長下的熊果酸色譜峰符合要求并且吸收值最大。

圖1 腎茶供試品3D吸收圖

圖2 波長190 nm下熊果酸對照色譜峰

圖3 波長203 nm下熊果酸對照色譜峰

圖4 波長210 nm下熊果酸對照色譜峰

2.2.2 流動相系統考察

分別使用五種不同配比流動相進行試驗：①乙腈∶水=68∶32、②乙腈∶0.1%磷酸=68:32、③乙腈∶1%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶3%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32，結果見表1、圖5。從結果看出分離度和拖尾因子均符合要求的只有③和⑤，為了增大以后檢測的容錯率，故選用⑤乙腈∶5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32為熊果酸檢測流動相。

表1 流動相系統考察

①乙腈∶水=68∶32、②乙腈∶0.1%磷酸=68∶32、③乙腈∶1%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶3%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32、③乙腈∶5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32。

2.3 方法學考察

2.3.1 色譜條件

色譜柱：GL Science C18(4.6×250 mm，5 μm)、流動相為乙腈-5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=68∶32，檢測波長為203 nm；柱溫：33℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL。

2.3.2 專屬性

取腎茶醇提液、熊果酸對照品溶液、空白溶劑按2.3.1的條件進樣分析，記錄色譜圖，結果見圖6。結果顯示空白溶劑不干擾檢測，熊果酸能與臨近峰分離度>1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

圖6 腎茶提取物專屬性考察色譜圖

2.3.3 線性

液相程序調整2.1.2中熊果酸對照品溶液進樣量分別為2、4、6、8、10、12 μL，記錄色譜圖。根據表1分析得出回歸方程為y=4401.2196x-14708.6，R=1.0000，表明該方法測得的熊果酸含量在54.926 ～329.556 μg是準確的。

表 2 腎茶供試品中熊果酸檢測方法學考察-線性

2.3.4 耐用性

表3 耐用性(溫度、流速、流動相組成)峰面積RSD%

圖7 腎茶供試品中熊果酸檢測方法學 考察色譜圖-耐用性(溫度)

圖8 腎茶供試品中熊果酸檢測方法學 考察色譜圖-耐用性(流速)

除各考察項變動外，其余項均同2.3.1中色譜條件。①柱溫：32、33、34℃；②流速：0.95、1.0、1.05 mL/min；③色譜柱型號：7F3719-07 wondaSil c18、6k3708-01 wondaSil c18、4DG71569 wondaCract OD；④流動相組成：乙腈-5%四氫呋喃(0.1%磷酸)=67∶33、68∶32、69∶31，結果見表3和圖7～9。結果表明在柱溫、流速、色譜柱或流動相組成發生微小變化時，熊果酸的峰面積基本保持一致，滿足系統適用性要求。

圖9 腎茶供試品中熊果酸檢測方法學 考察色譜圖-耐用性(流動相比例)

2.3.5 重復性

平行制備6份腎茶醇提液作為供試品，按2.3.1的條件進樣，記錄色譜圖，結果見圖10，并計算熊果酸含量和相對標準差RSD。重復性試驗峰面積的RSD=0.980%<3%，符合要求，重復性良好。

圖10 腎茶供試品中熊果酸檢測方法學考察色譜圖-重復性

2.3.6 準確度

取腎茶醇提液9份，每份2 mL，這9份供試液再分為三組，按其中熊果酸含量的0.5倍、1倍、1.5倍添加熊果酸對照品，混勻后過0.45 μm濾膜，按2.3.1中條件進樣，記錄譜圖，根據重復性試驗的結果計算各供試溶液中熊果酸含量，并計算回收率及其相對標準偏差RSD。準確度的試驗結果在92%～105%范圍內，回收率相對標準偏差RSD=2.04%，表明該法測熊果酸含量的結果與實際值較為接近，準確度較好。

表4 腎茶供試品中熊果酸檢測方法學考察-準確度(加標回收率)

3 討論

熊果酸是腎茶中起主要藥理作用的化學物質之一，目前已有的制劑將其定為質量檢測的標準物質，但該制劑上市時間早，檢測方法薄層層析不夠準確。試驗發現采用目前已發表的文獻中對熊果酸檢測的方法進行試驗[4-6]，均難以達到《中國藥典2020》[7]中規定的分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，因此建立腎茶中熊果酸的HPLC檢測方法對腎茶新制劑的開發具有重要的研究指導意義。

本研究主要通過HPLC法建立腎茶中熊果酸的檢測方法并進行方法學考察，為其鑒定和質量控制提供標準，該法檢測到的熊果酸不僅能有較好的分離度，而且檢驗時間短，大大縮短了藥品研發所需要的時間。參照《中國藥典2020》，本研究分別對檢測波長、專屬性、耐用性、重復性和準確度進行考察，其結果均符合《中國藥典2020》要求。

在多次研究探索過程中，發現添加四氫呋喃可以調整峰形，但其也有減少出峰時間的作用，因此不宜添加過多，以免造成分離度不夠；四氫呋喃還可能腐蝕柱子或者液相里的某些零件，使用時應當注意器材是否會被四氫呋喃腐蝕；四氫呋喃容易被氧化，因此用之前需要檢查試劑瓶中液體是否有分層現象。