基于ADME和“Lipinski規則”的金葉敗毒顆粒輔助治療新型冠狀病毒肺炎的活性成分研究

吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，艾尼瓦爾·吾買爾，努麗比亞·買合木提，買爾旦·玉蘇甫，木哈待斯·努爾，卡依賽爾·阿布都肉蘇力，周文婷*

1新疆醫科大學藥學院；2新疆醫科大學維吾爾醫學院，烏魯木齊 830011

2019年12月底我國武漢市爆發新型冠狀病毒肺炎疫情，由這一病毒導致的疾病的正式名稱為COVID-19(coronavirus disease 2019)，為一種新型冠狀病毒(原名2019-nCoV，現名SARS-CoV-2)感染引起的急性傳染病[1]。國家衛生健康委員會發布了一系列診治方案，《國家方案》試行第三版提出了中醫藥治療的方案，并推薦了多個中成藥在診治過程中使用，以共同促進COVID-19臨床療效的提高[2]。

金葉敗毒顆粒(Jinyebaidu granules，JYBDG)是華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院院內制劑，是由金銀花、大青葉、蒲公英和魚腥草組成的。臨床上主要治療溫熱病，特別是上焦熱毒證，包括病毒性肺炎、急性上呼吸道感染、流行性感冒等急性病毒性疾病。還可以用于SARS病毒感染的預防和治療，取得了很好的預防效果[3]。本研究基于ADME參數和Lipinski規則對金葉敗毒顆粒的活性成分進一步篩選，其活性成分與JYBDG作用于COVID-19的核心靶點進行分子對接，為后續研究提供參考方向，提高篩選效率。

1 材料與方法

1.1 基于ADME和“Lipinski 規則”評估

JYBDG 4味中藥通過TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，TCMID數據庫(http://bionet.ncpid.org/)，BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)等數據庫進行成分的獲取。本文利用Lipinski的五規則即分子量(MW<500)、脂水分配系數(AlogP<5)、氫鍵供體數(Hdon<5)、氫鍵受體數(Hacc<10)和旋轉鍵(RBN<10)篩選RDNI的活性成分[4,5]。為了確保JYBDG成分鑒定的準確性和相關性，本文還納入了西北農林科技大學系統藥理學實驗室(陜西楊凌)的篩選標準[6]，即藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30、Caco-2 細胞滲透性>-0.4和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18。DL是與良好的臨床療效相關聯的物理化學性質及生物學特性。DL越大，則成藥性越高[7]。對于通過口服途徑給藥的藥物，OB是最重要的藥代動力學參數之一，是衡量藥物進入人體循環系統有效性的一個重要指標。良好的口服生物利用度是化合物具有藥理活性的基本前提之一[8]。

1.2 JYBDG活性成分作用靶點的篩選

JYBDG活性成分通過TCMSP數據庫預測及篩選活性成分對應的靶點。然后，將所有靶點通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)以“homo sapiens”(人屬)為關鍵詞進行基因-蛋白名稱轉化，即將全部蛋白名稱轉換為基因名稱。

1.3 獲取COVID-19相關的基因

基于The Human Gene Database(GeneCards)(https：//www.genecards.org/)數據庫，以“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞檢索與新型冠狀病毒肺炎的相關的基因。

1.4 JYBDG治療COVID-19潛在作用靶點預測

以上“1.2和1.3”項下得到的靶點通過Venny2.1(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪圖軟件，將藥物預測的靶點與疾病的靶點進行映射，獲得“JYBDG”治療COVID-19的潛在作用靶點。

1.5 網絡拓撲參數預測核心治療靶點

以上“1.4”項下得到的潛在靶點和作用于潛在靶點的活性成分及其來源的中藥通過Cytoscape3.7.1軟件(版本：3.7.1，https://cytoscape.org)構建中藥-潛在成分-潛在靶點網絡圖(herb-potential compound-potential target，HB-pC-pT network)。并運用網絡拓撲參數篩選JYBDG治療COVID-19的核心治療靶點，即以節點度值(degree)超過平均值為標準篩選出核心靶點。一個degree代表在蛋白相互作用網絡中與該節點直接相互作用的節點的數目。節點的大小與度數成正比。節點的度越大則其參與的生物功能越多，其生物學重要性越強[9]。

1.6 基因富集分析

為了系統的闡明JYBDG治療COVID-19的作用，通過DAVID數據庫(版本：6.8，https://david.ncifcrf.gov/)對以上“1.4”項下得到的潛在靶點基因功能(GO)和相關通路(pathway)進行富集分析。

1.7 受體與配體的前處理及分子對接

1.7.1 配體前處理

借助ZINC數據庫(http://zinc.docking.org/)對“1.1”項下得到的活性成分結構進行確證，并以mol格式文件保存。在PyMol軟件(https://pymol.org/)中檢查空間結構無誤后，轉換為pdb格式。將結構件載入AutoDock Tools 1.5.6程序，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認可旋轉，保存為pdbqt格式，作為對接配體。

1.7.2 受體前處理

采用AutoTools對以上“1.5”項下收集的治療核心靶點的晶體結構蛋白進行預處理，刪除多余的蛋白鏈和配體、加氫去除水分子，計算Gasteiger電荷，保存為pdbqt文件，作為用于做分子對接的受體。

1.7.3 分子對接

以上預處理的配體和受體使用Autodock Vina(版本：1.2，http://vina.scripps.edu/index.html)進行小分子與蛋白對接。最后取優勢構象進行分析，并用Schrodinger(https://www.schrodinger.com)軟件作圖。

2 結果

2.1 金葉敗毒顆粒活性成分分子庫篩選

JYBDG的4味中藥通過TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM數據庫收集445個成分，其中248個來自金銀花，75個來自大青葉，72個來自蒲公英，50個來自魚腥草(表1)。將成分通過ADME和“Lipinski規則”篩選得到47個活性成分，其中3個來自大青葉，3個來自魚腥草和41個來自金銀花(表2)。

表1 JYBDG 4味中藥的總成分Table 1 Total compounds of 4 herbs of JYBDG

表2 JYBDG活性成分的ADME篩選Table 2 Candidate compounds from JYBDG screened by ADME

續表2(Continued Tab.2)

2.2 活性成分作用靶點的獲取

以上得到的47個活性成分通過TCMSP數據庫篩選得到392靶點，此靶點通過Uniprot數據庫進行基因名稱-蛋白名稱轉換，并刪除重復的靶點名稱后得到128個作用靶點。

2.3 預測JYBDG治療COVID-19的靶點結果

根據GeneCards數據庫檢索COVID-19的治療靶點，得到251個COVID-19的治療靶點。運用Venny2.1軟件將JYBDG的作用靶點與COVID-19的治療靶點取交集，得到20個JYBDG治療COVID-19的潛在靶點(見圖1)。

圖1 JYBDG治療新型冠狀病毒肺炎靶點韋恩圖Fig.1 The venn diagram of targets in treatment of COVID-19 with JYBDG

2.4 HB-pC-pT 網絡及核心靶點的篩選

以上獲取的20個潛在靶點對應的成分有18個，來源于金銀花、大青葉和魚腥草。3個中藥、18個潛在成分及其20個潛在靶點通過Cytoscape3.7.1軟件構建HB-pC-pT網絡，以闡明中藥、潛在成分和潛在靶點之間的關系(圖2)。該網絡由41個節點(3個中藥、18個潛在成分和20個潛在靶點)和71個邊緣組成。HB(綠色八角形)、pC(黃色四角形)和pT(紅色圓形)之間的邊緣代表相互作用。節點代表蛋白，邊代表功能的相關性，線條越多表示關聯度越大。對于成分而言，山奈酚(kaempferol)、甘草酚(glycyrol)和靛玉紅(indirubin)擁有超過5個靶點，說明在這個網絡中應存在著能夠作用于JYBDG大部分作用靶點的少數關鍵化合物。可能代表這個組方的大部分療效，即可能是JYBDG的主要療效物質。從靶點的角度來看，靶點平均節點度值為2.9，超過平均度值的靶點有5個，包括PTGS2(degree=16)、PTGS1(degree=8)、NOS3(degree=3)、PPARG(degree=3)和NOS2(degree=3)。圖2中靶點的degree值大小和與圈形大小成正比。Degree值大的靶點在網絡中起著關鍵的作用，其很可能是JYBDG治療COVID-19的核心靶點。

圖2 中藥-潛在成分-潛在靶點網絡圖Fig.2 HB-pC-pT network

2.5 基因富集分析結果

20個潛在靶點通過DAVID數據庫進行富集分析，共富集出256條生物功能信息。其中生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組分(cellular component，CC)等GO生物功能有189條，信號通路有67條。為了更精準了解JYBDG治療COVID-19可能的作用機制，KEGG信號通路以FDR≤0.01(錯誤發現率)為條件進一步篩選，FDR表示在富集分析中越小，就代表富集顯著程度就越高。如表2所示，獲得16條信號通路，將FDR值由低到高排序。

表3 6條顯著富集的KEGG通路(FDR≤0.01)Table 3 Sixteen significantly enriched KEGG pathways (FDR ≤ 0.01)

續表3(Continued Tab.3)

2.6 分子對接分析結果

將JYBDG的47個活性成分在通過ZNIC數據庫以mol格式保存、在PyMol軟件以pdb格式保存、在AutoDock Tools 1.5.6程序以為pdbqt格式保存過程中，至保留了38個成分。以JYBDG的38個活性成分作為配體，以“2.4”項下得到的5個核心治療靶點為受體，進行分子對接 按照結合能(score)來判斷活性成分與靶點的匹配度，一般認為配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生的作用可能性越大[10]。以score≤-7.0 kJ/mol 作為篩選標準。表4結果顯示，甘草酚(glycyrol)、junipene(MOL002697)和山奈酚(kaempferol)均與PTGS2，BNL(MOL003056)和山奈酚與NOS2以及BNL與PTGS1具有較強的結合活性。為了證實JYBDG的主要活性成分通過與相關蛋白相互作用治療COVID-19的潛在療效，進一步進行分析結合模型，表中可以看出來，氫鍵和pi-pi相互作用對小分子與蛋白的識別和穩定性起著關鍵作用，計算分析進一步闡明了活性成分與蛋白之間精確的分子機制。

表4 JYBDG活性成分與作用于COVID-19核心靶點的分子對接(結合能≤-7.0 kJ/mol)Table 4 Molecular docking of JYBDG active components with COVID-19 core targets (binding energy≤-7.0 kJ /mol)

續表4(Continued Tab.4)

3 討論

中醫認為COVID-19屬于“濕毒疫”范疇，源于感受“濕毒之邪”致病。在中醫“辨證施治”理論指導下，中藥在“濕毒疫”的運用具有獨特的優勢[11]。本文運用中藥網絡藥理學方法，在金葉敗毒顆粒活性成分的ADME和Lipinski五項規則的基礎上，結合各種中藥的法定質量控制指標，篩選整合分析并建立可靠的成分庫。以COVID-19為疾病模型，借助分子對接技術和網絡藥理學方法構建相應的藥理網絡。

金葉敗毒顆粒藥味簡單，均是寒性藥物，根據“熱著寒之”的治療原則，可用于溫熱病。方中金銀花性甘寒，既能清熱解毒，又可疏散風熱，治療外感風熱、溫病初起。近期研究報道[12]，通過SARS-CoV-2 3CL水解酶的中藥小分子抑制劑，作者根據多地市制定的中醫藥治療方案進行統計，推測的12種中藥復方中10種復方均包含金銀花。又研究報道[13]，預防COVID-19的44個方劑中，金銀花使用頻次有23次，排名第3位。大青葉性寒具有清熱解毒、涼血消斑的功效。對各種病毒有抑制感染并有抑制增殖作用[14]。魚腥草具有清熱解毒、利尿通淋等功效。抗菌和抗病毒作用明顯，臨床用于肺癰吐膿、痰熱喘咳，熱痢和熱淋等[15]。

HB-pC-pT 網絡分析結果表明，山奈酚、甘草酚和靛玉紅可能是JYBDG的主要療效物質。其中山奈酚和靛玉紅已有報道具有抗炎、抗病毒和抗腫瘤作用[16,17]。本課題組前期報道[18]，山奈酚同時與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2具有較好的結合活性。且作用于PTGS2、PTGS1、NOS3、PPARG和NOS2等5個核心治療靶點。進一步確定山奈酚可能作用于COVID-19的有效物質基礎。此外，靛玉紅以及分子對接結果較好的junipene和BNL等主要活性成分與COVID-19尚未相關研究報道，待進一步研究。KEGG通路富集分析結果表明，JYBDG活性成分作用的潛在靶點主要參與TNF 信號通路、弓形體病、肺結核和甲型流感等，進一步分析發現，上述通路涉及病毒、細菌、免疫調節腫瘤和炎癥等各個方面。

綜上所述，從中可以看出JYBDG治療COVID-19是通過多成分、多靶點、多通路的協同作用來發揮療效的。鑒于網絡藥理學的局限性，需要開展實驗研究，為JYBDG治療COVID-19以及后期的藥物開發提供理論和實驗依據。