龍膽苦苷對非酒精性脂肪肝TLR-4/NF-κB和AMPK/Nrf2通路的影響

許瓊梅，高 雅，李梓萌，韋日明，馬曉輝，晉 玲*，張可鋒*

1桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 5410041；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指排除酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和氧化應(yīng)激關(guān)系密切[1,2]。隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD在我國的發(fā)病率呈上升趨勢，遺傳、糖尿病、高脂飲食、運動缺乏等內(nèi)外因素都能誘發(fā)NAFLD[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，NAFLD由于氧化應(yīng)激及胰島素抵抗二次或多重打擊引起的，這一理念被國內(nèi)外學(xué)者廣泛認同[4]。因此抗炎抗氧化等經(jīng)典策略可作為本病的基本治則。TLR-4/NF-κB信號通路是經(jīng)典的炎癥通路，該通路是對各種刺激引起肝臟變化最常見的通路[5]。TLR-4的激發(fā)通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB，繼而促進炎癥因子釋放，最終誘導(dǎo)肝細胞壞死并激活炎癥級聯(lián)反應(yīng)。抑制TLR-4/NF-κB信號通路的活化是減輕肝組織炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路，也是下調(diào)與氧化應(yīng)激有關(guān)的炎性表達的標志。同時，AMPK/Nrf2信號通路在體內(nèi)抵抗氧化應(yīng)激和改善脂質(zhì)沉積過程中發(fā)揮重要作用。Nrf2是細胞防御系統(tǒng)抵抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子，有證據(jù)表明Nrf2的遺傳缺失與更嚴重的NAFLD相關(guān)[6]。AMPK是細胞能量穩(wěn)態(tài)和炎癥的中心調(diào)節(jié)劑，能夠調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成，并抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[7]。由于Nrf2和AMPK在氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵作用，該通路可作為治療肝臟脂質(zhì)浸潤和炎癥的潛在治療靶標。同時，已有研究表明AMPK/Nrf2通路可能是調(diào)節(jié)非酒精性脂肪肝發(fā)展進程的關(guān)鍵通路[8]。

龍膽苦苷(gentiopicroside，GPS)是由龍膽科植物龍膽草中提取的裂環(huán)烯醚萜苷類[9,10]，藥理研究表明GPS具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、清除自由基等臨床功效，其保肝利膽療效顯著[11]，然而其保肝機制尚未明確。許多研究顯示GPS在抗病原微生物、胃腸道、胰腺、心血管疾病甚至呼吸系統(tǒng)疾病與神經(jīng)精神疾病等方面也有較大的應(yīng)用潛力[12]。同時，GPS具有顯著抗氧化和保護肝臟的作用，并能促進膽汁分泌和其他生物活性。有報道表明GPS對化學(xué)物質(zhì)和D-半乳糖胺/脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷小鼠具有保護作用[13]。另外，GPS可通過AMPK-PPARα信號通路改善酒精性脂肪肝病癥狀，但是目前關(guān)于NAFLD模型中GPS與TLR-4/NF-κB、AMPK/Nrf2信號通路之間的關(guān)聯(lián)的研究尚未報道。故本實驗通過建立大鼠NAFLD模型，采用二甲雙胍作對照，初步研究GPS保護肝臟的作用及對TLR-4/NF-κB、AMPK/Nrf2信號通路的調(diào)控作用，為GPS用于臨床治療NAFLD提供依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 動物

雄性SD大鼠66只，體質(zhì)量200 ± 20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK(湘)2016-0002。所有大鼠均飼養(yǎng)在溫度22 ± 2 ℃、濕度45%～50%、12 h光照/暗循環(huán)的環(huán)境下，自由獲取食物和水，實驗前適應(yīng)1周。

1.2 實驗藥物及試劑

GPS(南京道斯夫生物科技有限公司，純度>98%，批號：181116A)；高脂飼料(D12492，江蘇協(xié)同藥業(yè)生物工程有限公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、甘油三酯(TG)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(Elabscience公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(南通市碧云天生物技術(shù)研究所)；NF-κBp-p65、NF-κBp65、AMPK、p-AMPK抗體、Nrf2抗體(美國CST)；TLR-4抗體(英國Abcam)；β-actin單抗(天錫傲銳東源生物科技有限公司)；辣根酶標志的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Super ECL Plus超敏發(fā)光液(北京普利萊基因科技有限公司)。

1.3 儀器

H2050R型臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機廠)；Epoch型全波長酶標儀(美國Bio-Tek公司)；AUW220D型半微量電子天平(日本島津公司)；O1ympus BX51型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器(太倉市實驗設(shè)備廠)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組及處理

66只SD大鼠隨機均分為兩組：正常組(n=13)和高脂組(n=53)。正常組喂普通飼料，高脂組喂高脂飼料。喂養(yǎng)8周后，兩組各隨機抽取3只小鼠進行病理檢查，評估NAFLD模型是否成功[14]。確定模型成功后，高脂組隨機均分為模型組、二甲雙胍組(200 mg/kg)和GPS高、中、低劑量(120、60、30 mg/kg)組，每組10只。模型組繼續(xù)喂高脂飼料，各用藥組在喂高脂飼料的同時灌胃相應(yīng)劑量的藥物，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每天1次，共6周。14周末，禁食不禁水16 h，摘除眼球取血，收集肝臟，肝左葉置于4%多聚甲醛中固定，肝右葉-80 ℃保存。

2.2 血清指標檢測

靜置血液樣本2 h后置于高速冷凍離心機4 500 rpm，4 ℃離心15 min，收集血清。嚴格按照試劑盒說明書步驟測定血清中ALT、AST、SOD、GSH-Px、MDA、TC、TG、LDL-C、HDL-C的活性或含量。

2.3 胰島素抵抗情況

葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FBG)，ELISA法檢測血清空腹胰島素(FINS)含量，胰島素抵抗指數(shù)按穩(wěn)態(tài)胰島素評價指數(shù)(HOMA-IR)計算：HOMA-IR = FINS×FBG/22.5。

2.4 肝組織指標檢測

各取相同位置肝臟組織100 mg，加入磷酸鹽緩沖液研磨制成10%(W/V)肝組織勻漿，根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測肝組織中AMPK、p-AMPK、Nrf2、NF-κBp-p65、NF-κBp65、TLR-4蛋白表達水平

稱取各組大鼠肝葉相同部位約60 mg置于勻漿器中，加入RIPA裂解液于冰上研磨制成勻漿，離心后吸取上清液，嚴格按照BCA法測定蛋白濃度并進行定量，煮沸后使其變性，貯存于-20 ℃冰箱中待用。制備電泳膠(10%的分離膠和5%的濃縮膠)，用移液槍將變性蛋白和Marker加入上樣孔，進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V)分離蛋白，于冰浴中300 mA、70 min條件下轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，再用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，TBST洗滌3次后加入一抗4 ℃孵育過夜；次日，二抗孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影，Quantity One 4.6軟件分析蛋白灰度值，并以β-actin為內(nèi)參，計算各組AMPK、p-AMPK、Nrf2、NF-κBp-p65、NF-κBp65、TLR-4蛋白的相對表達量。

2.6 肝組織病理學(xué)檢查

根據(jù)油紅O染色方法，將肝臟冰凍切片，60%異丙醇浸洗2 min，油紅O工作液染色，蘇木精復(fù)染，甘油明膠封片。封片后光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝肝臟脂質(zhì)沉積情況。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 GPS對NAFLD大鼠血清中ALT、AST的影響

與正常組相比，模型組中的ALT和AST活性明顯增高(P<0.01)。與模型組相比，二甲雙胍組和GPS各劑量組中ALT和AST活性均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，表明GPS對肝臟具有一定的保護作用，結(jié)果見表1。

表1 GPS對NAFLD大鼠血清中ALT、AST的影響Table 1 Effect on the serum ALT and AST of

3.2 GPS對NAFLD大鼠血清中MDA、SOD、GSH-Px的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組和GPS各劑量組能一定程度地降低NAFLD大鼠血清中MDA的含量(P<0.05或P<0.01)，且提高SOD、GSH-Px的活性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，表明GPS保護肝臟可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，結(jié)果見表2。

表2 GPS對SOD、GSH-Px和MDA的影響Table 2 Effect of GPS on the serum SOD,GSH-Px and

3.3 GPS對NAFLD大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

與正常組相比，模型組中的TC、TG、LDL-C水平明顯增高，而HDL-C明顯降低(P<0.01)，表明本實驗建立的NAFLD動物模型成功。與模型組相比，二甲雙胍組和GPS各劑量組均能不同程度地降低NAFLD大鼠的TC、TG和LDL-C水平，且提高HDL-C水平(P<0.05或P<0.01)，說明GPS能改善NAFLD大鼠的脂質(zhì)代謝從而保護肝臟。結(jié)果見表3。

表3 GPS對血清中TC、LDL-C、HDL-C、TG的影響Table 3 Effect of GPS on the serum TC,LDL-C,HDL-C and

3.4 GPS對NAFLD大鼠胰島素抵抗水平的影響

與正常組相比，模型組中的FINS、FBG、HOMA-IR水平明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組和GPS高、中劑量組FBG、FINS、HOMA-IR水平顯著降低(P<0.01)，GPS低劑量組FBG水平顯著降低(P<0.01)，F(xiàn)INS、HOMA-IR水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明GPS能改善NAFLD大鼠的胰島素抵抗水平。結(jié)果見表4。

表4 GPS對胰島素抵抗的影響Table 4 The of GPS effects on insulin

3.5 GPS對NAFLD大鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍和GPS各劑量組都能有效抑制NAFLD大鼠肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高(P<0.01或P<0.05)，表明GPS能抑制炎癥反應(yīng)從而保護肝臟。結(jié)果見表5。

表5 GPS對肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6的影響Table 5 Effect of GPS on the hepatic TNF-α,IL-1β and

3.6 GPS對NAFLD大鼠肝臟中TLR-4/NF-κB及AMPK/Nrf2通路蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中NF-κBp-p65、TLR-4水平顯著升高而AMPK、Nrf2水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍和GPS各劑量組都能有效抑制NAFLD大鼠肝臟NF-κBp-p65與TLR-4水平的升高，同時上調(diào)AMPK和Nrf2的表達水平(P<0.01或P<0.05)，表明GPS能通過調(diào)控TLR-4/NF-κB及AMPK/Nrf2通路從而保護肝臟，結(jié)果見表6。

圖1 GPS對TLR-4/NF-κB及AMPK/Nrf2的影響Fig.1 Effect of GPS on TLR-4/NF-κB and AMPK/Nrf2注：A：正常組；B：模型組；C：二甲雙胍組；D：GPS低劑量組；E：GPS中劑量組；F：GPS高劑量組；下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Metformin group;D:GPS-low dose group;E:GPS-medium dose group;F:GPS-high dose group;The same below.

3.7 GPS對大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

油紅O染色結(jié)果顯示，正常組(圖2A)大鼠無明顯脂滴和炎性浸潤，模型組(圖2B)大鼠肝臟出現(xiàn)大面積的紅色脂肪滴，有明顯炎性細胞浸潤。二甲雙胍組(圖2C)和GPS各劑量組(圖2D-F)肝臟紅色脂滴明顯減少，炎性細胞數(shù)量明顯減少。

圖2 肝組織油紅O染色(200×)Fig.2 Liver tissue oil red O staining (200×)

4 討論

近年來NAFLD的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢，已成為慢性肝病及肝功能異常的主要病因之一[15]。目前用于治療NAFLD的相關(guān)藥物多數(shù)需要通過肝臟代謝，在治療NAFLD的同時也加重了肝臟的負擔(dān)，而且藥物對NAFLD治療效果有限，尚未發(fā)現(xiàn)特異性較強的藥物[16]，因此，尋找到療效確切且副作用小的藥物來治療NAFLD有較大的現(xiàn)實意義。

高脂飲食能引起血清中游離脂肪酸(FFA)增加，F(xiàn)FA在體內(nèi)不斷積累引起肝損傷，細胞膜通透性增高，導(dǎo)致細胞中ALT、AST溢出進入血液[17]。模型組血清中ALT、AST的活性升高，伴隨著TC、TG、LDL-C含量上升，HDL-C含量下降，表明本實驗成功建立NAFLD模型。研究結(jié)果顯示，GPS有效改善NAFLD，并對轉(zhuǎn)氨酶和血脂有調(diào)節(jié)作用，對肝臟起保護作用。

NAFLD的具體發(fā)病機制尚不清楚，目前“多重平行打擊”發(fā)病機理已被廣泛接受。炎癥、氧化應(yīng)激和胰島素抵抗等多種因素共同導(dǎo)致了NAFLD的發(fā)生與進展[18,19]。IR為中心引起的肝臟脂肪浸潤產(chǎn)生大量FFA，機體氧化途徑無法處理過量FFA則會導(dǎo)致TG增多，進而引起脂肪堆積誘發(fā)脂肪變性[20]。同時FFA增多刺激肝臟枯否細胞分泌炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子TNF-α、IL-1β和IL-6，促進炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致肝細胞炎性浸潤、壞死及纖維化的發(fā)生[21]。肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)時，TLR-4與其配體結(jié)合激活NF-κB，從而引起一系列的炎性因子的合成和釋放，誘發(fā)機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[22]。本實驗結(jié)果表明，GPS高、中、低劑量組均能降低胰島素抵抗指數(shù)、TG、TC、LDL-C及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高HDL-C水平，能夠有效抑制TLR-4及NF-κB信號通路，其中GPS高劑量組改善情況最明顯，提示GPS可能通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，調(diào)控TLR-4/NF-κB通路保護肝臟。

氧化應(yīng)激是非酒精性脂肪肝病公認的損傷因素之一，肝細胞內(nèi)富含線粒體有利于氧化FFA，為細胞提供能量的同時還會產(chǎn)生大量活性氧自由基[23]。機體的抗氧化防御系統(tǒng)可以通過抑制自由基產(chǎn)生、清除自由基、修復(fù)損傷及誘導(dǎo)抗氧化酶發(fā)揮保護作用，SOD和GSH-Px為重要的抗氧化酶，能夠有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)物形成，起到保護機體的作用[24]。MDA為自由基參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其異常表達可嚴重破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)，引起細胞腫脹、壞死[25]。AMPK的激活可促進下游分子Nrf2的細胞核轉(zhuǎn)位，上調(diào)Nrf2的表達[26]。Nrf2通過調(diào)節(jié)因子發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，介導(dǎo)下游多種抗氧化蛋白和酶如HO-1減輕肝臟氧化應(yīng)激[27]。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，GPS各劑量組可明顯增強SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，同時顯著增強p-AMPK、Nrf2蛋白表達水平，提示GPS可能激活A(yù)MPK/Nrf2信號通路，進而抑制氧化應(yīng)激從而達到保肝作用。

綜上所述，GPS可有效改善NAFLD大鼠損傷狀況，調(diào)節(jié)胰島素抵抗情況，抑制氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)，調(diào)控TLR-4/NF-κB和AMPK/Nrf2信號通路，為臨床應(yīng)用提供新策略。