鹽地堿蓬對2型糖尿病大鼠胰腺Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

張國偉，陳新新，田春雨*，馬雷雷，付文浩，李繼安，王自善，付常寬

1華北理工大學中醫學院，唐山 063210；2清華大學醫院，北京 100084

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的碳水化合物、蛋白質和脂肪代謝失調的綜合癥，它是一種慢性內分泌系統疾病，主要由長期高血糖引起。糖尿病主要分為1型和2型糖尿病(T2DM)，在最近的幾十年中，T2DM的全球患病率以驚人的速度持續增長，患病數量占DM患病總數的85%～95%。根據第九版全球糖尿病地圖最新數據顯示，截至2019年全世界約有4.63億糖尿病患者，中國為糖尿病患病人數最多的國家，約有1.164億糖尿病患者，預計2030年(1.405億)和2045年(1.472億)中國糖尿病患者數量仍居全球首位[1]。因此，開發能夠改善糖代謝的藥物已逐漸成為治療T2DM的研究重點。

鹽地堿蓬(Suaedasalsa(L.) Pall.)為一年生藜科草本植物，清代《本草綱目拾遺》引《脈藥聯珠藥性考》闡述了鹽地堿蓬的性味功效為“味咸性涼，清熱消積”，《河北省本草圖鑒》闡述了鹽地堿蓬性味歸經與功用為“微咸，涼。歸腎經。清熱消積。用于食積停滯，發熱”[2]?，F代研究發現鹽地堿蓬含有維生素類、微量元素類、脂肪酸類、黃酮類化合物類、色素類、多糖類物質、輔酶Q10、蛋白質等多種化學成分，具有抗炎、抗氧化、降糖等藥理活性[3-8]，但目前對其具體藥理作用、分子機制及其作用的具體通路尚不明確。本文進行動物實驗，通過構建2型糖尿病大鼠模型，以不同劑量鹽地堿蓬水煎劑進行干預，觀察血糖、GHb、C-P等指標，胰腺組織病理形態學以及胰腺組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白表達水平的變化，探討鹽地堿蓬改善T2DM大鼠糖代謝的相關作用機制，為應用鹽地堿蓬治療2型糖尿病提供實驗數據。

1 材料

1.1 供試動物

SPF級4周齡SD雄性大鼠70只，120±5 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0008，合格證號：1103221911004286。動物實驗經華北理工大學實驗動物倫理委員會審批，批準編號LX2019084。

1.2 藥物及試劑

鹽酸二甲雙胍片(格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號AAZ0889)；鹽地堿蓬采摘于河北省唐山市曹妃甸地區，由田春雨教授鑒定；鏈脲佐菌素(北京博愛港生物技術有限公司，批號20180831)；糖化血紅蛋白(GHb)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20191008)；C-肽Elisa試劑盒(安迪華泰(中國)生物科技有限公司，批號AD201910)；β-actin、Bcl-2、Bax一抗(ABclonal，批號分別為9100026001、0075220402、3560003003)；凝膠試劑盒、Marker(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)。

1.3 儀器

穩益血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司，儀器編碼：1OH55IH1538)；組織脫水機(LEICA TP1020)；組織切片機(LEICA RM2245)；電泳儀(美國BIO-RAD伯樂)；成像系統ChemiDocTM CXRS+ System(美國BIO-RAD伯樂)；M200PR0酶標儀(瑞士TECAN公司)；正置顯微鏡(日本 OLYMPUS)。

2 實驗方法

2.1 造模及分組給藥

70只雄性SD大鼠給予維持飼料適應性喂養一周后隨機分為正常組(10只)和實驗組(60只)，正常組給予維持飼料及純水喂養，模型組給予高脂飼料(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)喂養，4周后大鼠禁食12 h腹腔注射STZ緩沖液(30 mg/kg)，正常組給予同劑量的生理鹽水腹腔注射，注射STZ 3天后，所有大鼠測FBG和PG2h。以16.7 mmol/L>FBG>11.1 mmol/L或PG2h>16.7 mmol/L為成模標準[9]，將成模的老鼠按血糖為模型組11只，二甲雙胍組11只，鹽地堿蓬低、中、高劑量組各11只。分組后給予給藥組不同劑量的藥物灌胃，參考文獻等效劑量換算[10]，二甲雙胍組每天灌胃量為90 mg/kg，鹽地堿蓬組低、中、高組每天灌胃量為405、810、1620 mg/kg(生藥量)[2]，正常組給予相對應的生理鹽水灌注，每周根據每只大鼠的體重變化調整灌胃給藥量，共給藥4周。

2.2 檢測指標

2.2.1 常規檢測指標

尾靜脈采血檢測大鼠FBG、PG2h和OGTT，檢測前12 h大鼠禁食不禁水，以25%葡萄糖按2.5 g/kg劑量灌胃，分別于灌胃前及灌胃后1、2 h尾尖取血測定各時間點血糖[11]；比色法檢測GHb；酶聯免疫法(Elisa)檢測C-P，根據FBG和C-P結果計算IR指數[12]；HE常規染色觀察胰腺組織形態學變化；參考文獻[13]對大鼠胰腺進行免疫組化中相關蛋白的檢測。

2.2.2 胰腺組織Western blot檢測

每1 mL RIPA裂解液中加入2 μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置于冰上備用。蛋白定量后加入上樣緩沖液并煮沸5 min后，通過SDS-PAGE分離樣品并轉移至PVDF膜。用TBST洗滌三次后，用BSA封閉2 h，TBST洗滌三次，將膜放置在不同的一抗中4 ℃孵育過夜。第二天用TBST洗滌三次，將膜與二抗在室溫下孵育2 h。然后用TBST洗滌三次，用極超敏ECL化學發光試劑檢測蛋白質，并使用圖像分析儀通過光密度測定法定量。

一抗包括針對Bcl-2、Bax、Caspase-3和cleaved-Caspase-3的兔單克隆抗體。針對β-actin的兔單克隆抗體和二抗(山羊抗兔)。

2.2.3 數據分析

3 實驗結果

3.1 鹽地堿蓬對T2DM大鼠FBG、PG2h的影響

與正常組相比，模型組及給藥組FBG、PG2h均明顯升高，結果具有顯著差異(P<0.01)；與模型組相比，鹽地堿蓬組大鼠FBG、PG2h降低，結果具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)(見圖1)。

圖1 鹽地堿蓬對T2DM大鼠FBG、PG2h的影響Fig.1 Effects of S.salsa on FBG and PG2h in T2DM 注：A為正常組；B為模型組；C為二甲雙胍組；D為鹽地堿蓬低劑量組；E為鹽地堿蓬中劑量組；F為鹽地堿蓬高劑量組(下同)。與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:A is the normal group;B is the model group;C is the metformin group;D is the low dose group of S.salsa;E is the medium dose group of S.salsa;F is the high dose group of S.salsa (the same below).Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

3.2 鹽地堿蓬對T2DM大鼠OGTT-AUC、C-P、IR指數及GHb的影響

與正常組相比，模型組OGTT-AUC、IR指數、GHb顯著升高(P<0.01)，C-P顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，鹽地堿蓬組OGTT-AUC、IR指數、GHb顯著降低(P<0.01)，C-P顯著升高(P<0.05或P<0.01)，結果具有統計學意義(見圖2)。

圖2 鹽地堿蓬對T2DM大鼠OGTT-AUC、C-P、IR指數及GHb的影響Fig.2 Effects of S.salsa on OGTT-AUC、C-P、insulin resistance index and GHb in T2DM 注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

3.3 鹽地堿蓬對大鼠胰腺組織病理形態的影響

與正常組相比，模型組胰島形態不規則，部分胰島細胞萎縮，細胞核邊緣化，胞漿出現空泡化，間質增生和胰島纖維化明顯；與模型組相比，鹽地堿蓬低劑量組胰島細胞形態、胰島內細胞數量和體積較模型組有所改善；鹽地堿蓬中劑量組胰島形態、空泡化、間質增生、胰島內的細胞數量和體積較模型組有所改善；鹽地堿蓬高劑量組胰島形態與模型組相比較為規則，無明顯空泡化、間質增生和胰島纖維化，且胰島內的細胞數量較模型組有所增加(見圖3)。

圖3 鹽地堿蓬對各組T2DM大鼠胰腺組織病理變化的影響(HE，×40)Fig.3 Effect of S.salsa on pathological changes of pancreas tissue in T2DM rats in each group(HE,×40)

3.5 Bax、Bcl-2蛋白在T2DM大鼠胰腺表達情況

與正常組相比，模型組胰腺組織中Bax蛋白平均光密度值顯著升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白平均光密度值顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，鹽地堿蓬組胰腺組織中Bax蛋白平均光密度值降低(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2蛋白平均光密度值升高(P<0.01)(見圖4～圖6)。

圖4 各組大鼠胰腺組織Bax表達結果(免疫組化，×40)Fig.4 Bax expression results in pancreas of rats in each group(IHC,×40)

圖5 各組大鼠胰腺組織Bcl-2表達結果(免疫組化，×40)Fig.5 Bcl-2 expression results in pancreas of rats in each group(IHC,×40)

圖6 各組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2蛋白平均光密度值比較Fig.6 Comparison of the average optical density values of Bax and Bcl-2 proteins in pancreatic tissue of rats in each 注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

3.5 Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白在T2DM大鼠胰腺表達情況

與正常組相比，模型組胰腺組織中Bax、Caspase-3、cleaved-caspase-3蛋白表達顯著上調(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達顯著下調(P<0.01)；與模型組相比，鹽地堿蓬組胰腺組織中Bax、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達顯著下調(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達顯著上調(P<0.01)(見圖7、8)。

圖7 Western blot檢測各組大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達電泳Fig.7 Expression of Bax,Bcl-2,Caspase-3 and cleaved-caspase-3 protein in pancreas of each group detected by Western blot

圖8 鹽地堿蓬對T2DM大鼠胰腺組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達的影響Fig.8 Effects of S.salsa on Bax,Bcl-2,Caspase-3 and cleaved-Caspase-3 protein expression in pancreatic tissue of T2DM 注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

4 討論

目前有關鹽地堿蓬降糖方面的研究報道較少，主要以體外實驗為主，其作用機理尚未明確。本實驗研究構建了T2DM大鼠模型，從凋亡途徑觀察鹽地堿蓬對其胰腺組織的作用，結果從FBG、PG2h、OGTT、GHb、C-P、IR指數可以看出，相較于正常組，模型組、二甲雙胍組和鹽地堿蓬低、中、高劑量組大鼠FBG、PG2h、OGTT、GHb、IR指數均明顯升高，C-P指數明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)，這表明T2DM大鼠模型構建成功。采用鹽地堿蓬治療后，與模型組相比，大鼠FBG、PG2h、OGTT、GHb、IR指數均明顯降低，C-P指數明顯升高(P<0.01)，表明鹽地堿蓬對糖代謝具有調節作用。從正常組、模型組與鹽地堿蓬組的比較結果可以看出，隨著給藥時間的延長，大鼠各項指標均有所改善，說明鹽地堿蓬改善糖代謝效果有一定的時效關系。

T2DM是一種內分泌代謝性疾病，研究表明，胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙是2型糖尿病發病的兩大機制，特別是胰島β細胞功能減弱或喪失，是導致胰島素分泌相對不足或絕對不足的根本機制,因此保護胰島組織是治療糖尿病的有效途徑之一[14]。正常的胰島結構是維持胰島正常生理學功能的基礎,在糖尿病的不同發展階段，胰島組織形態會出現相應的改變，這種改變是胰島功能障礙的基礎[15]。HE染色顯示模型組胰島形態不規則，部分胰島細胞萎縮，細胞核邊緣化，胞漿出現空泡化，間質增生和胰島纖維化明顯；與模型組相比，鹽地堿蓬可以改善胰島的形態和結構，從而改善胰島功能障礙，促進胰島β細胞分泌胰島素。

Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡的過程中起關鍵作用并激活Caspase家族蛋白，Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，Bax(促凋亡蛋白)的表達增加與Bcl-2(抗凋亡蛋白)的同時減少以及Bax/Bcl-2比率的升高是細胞凋亡的原因之一[16]，細胞應激物改變了Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員和抗凋亡成員之間相互作用的細胞內平衡，開放線粒體通透性轉換孔道(mPTP)，釋放CytC進入胞質與凋亡誘導因子結合，進而形成CytC-Apaf-1-Procaspase-9“凋亡體”[17]，繼之Caspase-9酶切Caspase-3酶原，啟動Caspase級聯反應，誘發細胞凋亡[18]，其中Caspase-3是最關鍵的凋亡執行蛋白。本實驗研究通過免疫組化和Western blot實驗發現，在模型組中Bax、Caspase-3、cleaved-caspase-3蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調；與模型組相比，鹽地堿蓬組Bax、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達下調，Bcl-2蛋白表達上調。表明鹽地堿蓬可以調節Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白的表達。

綜上所述，鹽地堿蓬可以降低T2DM大鼠FBG、PG2h、OGTT-AUC、IR指數以及GHb，升高T2DM大鼠C-P，能夠有效改善T2DM大鼠糖代謝，其作用機制可能與上調Bcl-2，下調Bax、Caspase-3、cleaved-Caspase-3的蛋白表達有關。