中性粒細胞胞外誘捕網在痛風中的作用

潘迎紫 吳玉寒 褚贊波 鄒榮鑫 李曉可 陳勇

【摘要】 痛風是一種常見的慢性炎癥性疾病，以其急性發病中的紅腫熱痛為特征，但它能在幾天內自行消退，這其中的發病過程非常復雜。近年來中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）作為一種新的抗炎機制，被發現在痛風的炎癥消退反應中也起著重要的作用。在這篇綜述中，筆者將討論在痛風炎癥機制中與NETs相關的細胞因子、NETs的經典釋放途徑以及其在痛風炎癥反應中的作用。研究NETs的作用將有助于開發新的治療方法。

【關鍵詞】 中性粒細胞胞外誘捕網 網捕死亡 痛風 NETs聚集物

[Abstract] Gout is a common chronic inflammatory disease characterized by red， swelling， hot and pain in its acute attack， but it can subside spontaneously within a few days， the pathogenesis of the subsidence is very complex. In recent years， as a new anti-inflammatory mechanism， neutrophil extracellular traps （NETs） has been found to play an important role in the inflammatory subsidence of gout. In this review， we will discuss the cytokines associated with NETs in the inflammatory mechanism of gout， the classical release pathways of NETs， and their roles of NETs in the inflammatory response of gout. Studying the role of NETs will help to develop new therapies.

[Key words] Neutrophil extracellular traps NETosis Gout NETs aggnets

First-authors address： Ningbo University School of Medicine， Ningbo 315000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.26.042

痛風是一種常見的慢性炎癥性疾病，其主要臨床特征表現在機體對單鈉尿酸鹽（monosodiumurate，MSU）晶體的炎癥反應，大致可分為4個階段，即無癥狀性高尿酸血癥期、急性發作期、間隙期以及痛風石和慢性痛風關節炎期。尿酸在體內是以離子形式的尿酸鹽存在，當血清尿酸水平大于正常閾值時，MSU晶體開始在組織中沉積，關節內MSU晶體持續沉積引發急性炎癥反應，同時伴有嚴重的關節疼痛、腫脹、發熱、發紅以及受累關節活動困難，發作時可出現輕度關節不適或刺痛的前期癥狀，通常在24 h內達到峰值。

1 中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）

1.1 定義 NETs指含有DNA、組蛋白和中性粒細胞蛋白質的細胞外結構，其中的蛋白質如骨髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）或鈣粒蛋白。在NETs的形成過程中，中性粒細胞通過蛋白酶處理組蛋白進行染色質重構，重構的染色質隨后結合抗菌蛋白和酶。然后，經過修飾的染色質通過一個稱為“網捕死亡”（NETosis）的過程釋放出來。NETs形成這一新形式的細胞死亡過程被稱為“網捕死亡”。NETs出現在炎癥部位，并可能由于局部DNA酶的降解導致壽命很短，因此檢測和量化NETs很困難[1]。

1.2 與中性粒細胞胞外誘捕網有關的細胞因子

1.2.1 白細胞介素-1β（IL-1β） IL-1β是一種固有免疫反應中的細胞因子，作用于多種細胞類型以引發炎癥反應。在痛風中，活性IL-1β主要是由MSU晶體觸發caspase-1以激活NALP3炎癥小體從而誘導產生的[2]。鑒于IL-1β在痛風發病機制中的重要作用，Mitroulis等[3]研究了抑制IL-1信號轉導對“NETs”形成的影響，該研究發現重組IL-1受體拮抗劑阿那白滯素（anakinra）大部分能抑制急性痛風患者血清中“NETs”的生成。為了區分阿那白滯素的作用是由于IL-1α或IL-1β信號的抑制，在刺激對照多形核白細胞（PMNs）之前，用抗IL-1β單克隆抗體（mab）處理離心滑液，得到抗IL-1β和阿那白滯素治療都有相似的抑制作用。此外，用重組IL-1β培養對照PMNs可誘導形成NETs[3]。

1.2.2 白細胞介素-8（IL-8） IL-8是一種趨化因子，在中性粒細胞活化和炎癥部位的募集中起著重要作用。它能刺激PMNs的黏附、脫粒和呼吸爆發。IL-8還具有吸引和激活單核細胞的能力，特別是在癌癥中，它不斷地產生并能刺激血管的生成[4]。

由于NETs是由激活的中性粒細胞形成的，可以推測IL-8可能參與NETs的形成。有研究表明，IL-8影響了NETs的形成，Brinkmann等[5]發現被IL-8激活的中性粒細胞能夠形成NETs。在其他特殊情況下，IL-8也可以參與NETs形成。胎盤來源的IL-8和合體滋養層膜微粒（STBM）能夠獨立地刺激中性粒細胞，導致體外NETs的發育[6]。Alfaro等[7]發現腫瘤源性IL-8可誘導粒細胞人骨髓源性抑制細胞（MDSC）從而形成NETs。

1.2.3 白細胞介素-18（IL-18） IL-18可由多種組織細胞產生，能誘導Th1細胞產生細胞因子（IFN-γ、IL-2、GM-CSF），能激活NK細胞的細胞毒活性，并能促進T細胞增殖。在痛風中，MSU參與caspase-1介導促炎性細胞因子IL-18的分泌，并促進細胞的炎癥發展。Jorgensen等[8]發現IL-18能夠通過調節中性粒細胞從而影響NETs的形成，而PMNs能有效地促進NETs的發展并消除感染。

1.2.4 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α） TNF-α是一種由激活的巨噬細胞產生的能抑制成骨細胞和刺激破骨細胞的細胞因子，具有殺傷靶細胞和促進細胞凋亡，參與局部炎癥和內皮細胞活化的作用。研究發現，TNF-α可以促進實驗性痛風中pro-IL-1β mRNA和IL-1β蛋白的表達，其跨膜形式足以引發MSU誘導的小鼠炎癥，同時在痛風患者中也可以檢測到TNF-α[9]。

相關研究表明，用TNF-α治療健康受試者的中性粒細胞可增強自由基的生成和“NETs”結構的形成，這是通過激活NADPH氧化酶和MPO介導的[4]。同時發現TNF-α是PMNs功能的有效激活劑，重組人腫瘤壞死因子刺激中性粒細胞呼吸爆發以及溶菌酶釋放，顯著提高了中性粒細胞對趨化肽（n-formyl-met-leu-phe，FMLP）的呼吸反應[4]。所以不難得出TNF-α也參與NETs的形成。

可見在痛風發病機制中一些起著重要作用的細胞因子，如IL-1β、IL-8、IL-18與TNF-α共同參與NETs的形成及發展。

1.3 NETs釋放的經典途徑 “網捕死亡”的發生需要蛋白酶和活性氧。NETosis需要以下步驟：（1）煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶產生活性氧（ROS）;（2）中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）和髓過氧化物酶（MPO）從顆粒轉移到細胞核;（3）精氨酸殘基在核內轉化為瓜氨酸。一種被稱為“azurosome”的復合蛋白質通過髓過氧化物酶（MPO）感知過氧化氫，它將活性氧轉化為鹵酸[10]。髓過氧化物酶的激活導致中性粒細胞顆粒的通透性增加和“azurosome”的解離。這一過程導致絲氨酸蛋白酶以及中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）的釋放，它們轉移到細胞核內去剪輯組蛋白[11]。肽基精氨酸脫氨酶-4（PAD4）是一種鈣依賴性酶，瓜氨酸精氨酸和甲基精氨酸殘基在組蛋白上。瓜氨酸化過程（即正電荷精氨酸向中性電荷氨基酸瓜氨酸的轉化）導致靜電吸引的損失[12]，因此核染色質會解聚，而染色質是NETs形成所必需的[13]。重要的是，NETs將髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）、組織蛋白酶G、絲氨酸蛋白酶3（PR3）和抗菌肽LL-37等幾種酶以及組蛋白暴露在細胞外空間。這些蛋白質和其他蛋白質使“NETs”能夠發揮其在微生物防御、凝血和免疫激活方面的作用。

2 中性粒細胞胞外誘捕網與痛風

2.1 痛風 痛風是由針狀尿酸單鈉晶體（MSU）積聚引起的急性炎癥性關節炎。大腳趾或腎臟等關節處的晶體沉積引發炎癥事件，炎癥事件迅速發展，然后消退。中性粒細胞在痛風急性炎性發作進展和緩解中的作用尚不清楚。局部免疫細胞（包括巨噬細胞、樹突狀細胞和滑膜細胞）激活后，中性粒細胞顯著涌入受影響關節的滑膜[14-15]。然后這些細胞吞噬MSU晶體，從而產生活性氧并啟動炎癥途徑。炎癥因子的激活和IL-1β的釋放招募了中性粒細胞和額外的免疫細胞。這些細胞產生趨化因子，進而加劇中性粒細胞的招募。這些中性粒細胞產生活性氧并釋放抗菌肽，如IL-1β和IL-8[16]。

2.2 痛風中NETs的形成 痛風中NETs的釋放是非常復雜的，并且受多種機制調控。從痛風患者中分離出的中性粒細胞能自發性地釋放NETs，痛風患者的血清能夠誘導健康捐贈者的NETs的形成。由于多種細胞因子可誘導NETs形成，Mitroulis等[3]首先表明痛風和NETs有關系，NETs是以MSU晶體作為刺激物形成的。白細胞介素-1（IL-1）試圖在NETs生成過程中發揮關鍵作用，因為IL-1受體拮抗劑阿那白滯素減少了NETs的生成[3]。Schorn等[17]表明MSU誘導的“網捕死亡”是由活性氧（ROS）介導的，活性氧是由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）介導的，線粒體活性氧的激活和釋放是“網捕死亡”的關鍵，由于NETs是由核內結構組成的，長期暴露NETs會增加自身免疫性的風險。

Sil等[18]證實了MSU誘導“網捕死亡”的另一個途徑，可能涉及巨噬細胞釋放的IL-1β來啟動“網捕死亡”。另外一個研究發現中性粒細胞需要嘗試吞噬MSU晶體，以便進行隨后的NETs釋放并形成NETs聚集物（aggnets）[19]。中性粒細胞并不真正吞噬MSU晶體，因為大多數晶體比中性粒細胞本身長得多。數據表明，只有一小部分參與MSU晶體吞噬及NETs釋放的PMN與MSU晶體相關[19]。這讓筆者得出這樣的結論：MSU晶體被吞噬是形成NETs的先決條件。聚集物的形成同時依賴活性氧（ROS）。進一步的研究提供了對MSU誘導的NETs機制的新見解，一些抑制P2Y受體的物質，如蘇拉明、PPADS和MRS2578可以限制MSU介導的NET的形成[19]。

2.3 NETs在痛風炎癥反應中的作用

2.3.1 NETs的促炎作用 炎癥激活后大量招募到痛風患者關節的中性粒細胞（PMN）會遇到MSU晶體，激活的中性粒細胞形成NETs。急性痛風時中性粒細胞的激活伴隨炎癥相關疼痛[20]。盡管NETs對宿主防御有好處，但其發生的代價是損害宿主的組織，因為NETs的成分，特別是組蛋白，可以引起對內皮細胞的損傷[21]。NETs是否有助于痛風發作的這一階段仍有待闡明，但很可能是因為通過形成了NETs，中性粒細胞會釋放出它們的危險顆粒。

2.3.2 NETs聚集物的消炎作用 炎癥部位的活化中性粒細胞釋放大量促炎介質，吸引并激活更多的粒細胞和其他免疫細胞。為了避免細胞激活和介質釋放的正反饋循環，需要嚴格控制這些過程。這種控制被認為主要通過誘導中性粒細胞凋亡和巨噬細胞吞噬作用的發揮[22]，導致中性粒細胞清除和釋放TGF-β等抗炎細胞因子。然而有報道稱，中性粒細胞在消炎過程中起著積極的作用，在這項研究中發現在高密度的中性粒細胞的條件下，由MSU晶體誘導的形成NETs更大的NETs聚集物[23]。聚集物致密地包裹MSU晶體，并通過固有的蛋白酶捕獲和降解促炎介質。

另外一項研究表明，與NADPH無關的“網捕死亡”發生在對MSU結晶的反應中。MSU晶體與溶酶體相互作用，中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）介導的染色質去密度在細胞死亡時發生，由此產生的NETs可能會將DNA涂層的MSU晶體隔離在痛風石中[24]。因此，中性粒細胞也可能在痛風炎癥的快速消退中發揮作用。但這種解決辦法不會導致MSU晶體的清除，因為它們在炎癥消散后仍留在受影響的關節中。

NETs聚集物的產生能夠給無癥狀-炎癥的MSU晶體的沉積提供一個支柱。而且，MSU晶體的沉積能通過雙能CT觀察到。這種疾病狀態稱為慢性痛風[25]。然而，痛風研究的這一領域仍有待證實明確。此外，NETs聚集物中的蛋白酶降解IL-6、TNF和巨噬細胞炎癥蛋白1α（MIP1α，也叫作CCL3）。因此，通過捕獲MSU和降解促炎細胞因子，MSU晶體和NETs在受影響區域的積累是炎癥消退的核心。值得注意的是，由于很難重現NETs聚集物降解細胞因子的數據，所以2016年的一項研究對中性粒細胞在痛風消退中的作用提出了挑戰[26]。

2.3.3 促炎及抗炎的分界點 Christine等發現MSU誘導的“NETosis”在產生活性氧（ROS）之前，導致中性粒細胞釋放促炎性介質[23]。相反，在痛風性關節炎的滑液或密集浸潤的炎性組織中，中性粒細胞密度較高，在體外和體內形成“aggnets”，從而產生抗炎作用[25]。所以可以猜測，多形核細胞在低細胞密度下進行促炎性“NETosis”，而在高細胞密度下形成抗炎性“aggnets”。但是到目前為止中性粒細胞的聚集和“NETs”形成之間的聯系仍然難以確定。中性粒細胞似乎在痛風發作的炎癥階段是有害的，但它們幫助炎癥消退的這一能力不能被忽視，仍需要進一步研究。

越來越多的證據表明，中性粒細胞參與了風濕病的進展，特別是“網捕死亡”的過程。痛風時，發炎是由于尿酸以針狀MSU晶體的形式沉淀而引起的。這些晶體在局部免疫細胞中的炎癥激活導致了中性粒細胞的迅速而劇烈的募集。在急性痛風發作期間，中性粒細胞的涌入伴隨著極其強烈的炎癥臨床癥狀。但是，中性粒細胞性炎癥有一個內置的保護裝置，激活的中性粒細胞形成中性粒細胞胞外誘捕網。在炎癥部位出現非常高的中性粒細胞密度下，形成NETs聚集物，致密地包裹MSU晶體，并通過固有的蛋白酶捕獲和降解促炎介質。通過聚集物局部去除細胞因子和趨化因子可以解釋急性炎癥如何在炎癥觸發器的存在下停止。許多研究已經證明患者受影響的組織中存在NETs物質，自身抗體通常針對中性粒細胞蛋白，而中性粒細胞蛋白是已知的在“網捕死亡”過程中釋放的。證據還表明，中性粒細胞是消炎所必需的。然而，關于NET釋放的機制仍然存在許多未解決的問題?？偟膩碚f，進一步研究NETs的作用將有助于開發新的治療方法。

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（收稿日期：2020-02-27） （本文編輯：張爽）