基于質量標志物的當歸抗炎功效近紅外快速評價

閆孟琳，叢龍飛，張子玥，姜 民，聶 磊，白 鋼*

(1.南開大學 藥學院 藥物化學生物學國家重點實驗室，天津 300353；2.山東大學 藥學院，山東 濟南 250100)

中藥材的質量控制研究一直是行業關注的焦點問題之一。現有質量控制方法的樣品前處理繁瑣復雜，僅適用于實驗室研究[1]。如何建立簡便快捷的質量評價方法，為中藥品質提供有力保障是目前中藥質量控制亟需解決的問題。近紅外光譜技術(NIRS)是一種整合分析技術，具有簡便快捷、低成本、綠色環保、不損壞樣品且可實現全程自動化檢測等特點。近年來，NIRS技術不斷發展，已被廣泛應用于制藥、農業、食品以及醫學等各個領域[2-5]，為中藥質量的快速評價提供了新的分析手段。

當歸(AS)為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，始見于《神農本草經》，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便之功效[6]。目前當歸以甘肅岷縣的質量最好，稱為“道地藥材”[7]。市場上流通的當歸均為栽培品種，主產自甘肅、云南、湖北、四川等地[8]。由于受品種、栽培種植方法、產地氣候、采收加工方法、運輸貯藏條件等因素的影響，當歸質量存在著較大差異。目前《中國藥典》(2020年版)雖然對當歸的水分、灰分、浸出物、揮發油、阿魏酸等的含量進行了限定，但這些指標缺乏與當歸功效的直接關聯，不能充分反映當歸藥材的質量屬性。質量標志物(Q-marker)概念的提出為當歸藥材的質量控制提供了新的思路，其特點是利用能夠體現中藥有效性及安全性并可以檢測的化學指標，對與中藥質量相關的物質基礎進行評價[9]。因此建立以Q-marker為核心的簡便快捷的分析體系用于當歸質量的評價具有重要意義。

核轉錄因子NF-κB被認為是炎癥過程的主要介質，在人體大多數炎癥疾病中呈高度激活狀態[10-11]。而當歸在臨床上可用于治療動脈粥樣硬化、肺纖維化等疾病，可能與其能夠影響NF-κB的轉錄，進而抑制組織炎癥、纖維化等過程有關[12-13]。本研究擬通過NF-κB抑制活性對當歸抗炎Q-marker進行篩選，運用近紅外光譜技術及化學計量學方法探討其含量與整體抗炎功效的關系，建立一種以中藥質量標志物為導向的當歸品質快速管理體系，為當歸的品質監管提供新的研究思路和方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC/Q-TOF Premier液質聯用儀、UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)(美國Waters公司)；高速臺式冷凍離心機(MIKRO 220R，德國Hettich公司)；CO2恒溫培養箱(FORMA311，美國Thermo公司)；熒光檢測儀(Modulus，美國Turner Designs公司)；布魯克傅里葉變換近紅外光譜儀(Tensor37，德國Brucker公司)；OPUS 7.0軟件(德國Brucker公司)。

色譜純乙腈、甲醇、甲酸(美國Sigma公司)；細胞培養用試劑(美國Gibco公司)；雙熒光素酶報告基因試劑盒(美國Promega公司)；綠原酸(Chlorogenicacid,CA)、歐當歸內酯A(Levistilide A,Lev A)(純度≥ 98%，上海源葉生物科技)；阿魏酸(Ferulicacid,FA)(純度≥ 99%，上海麥克林生化科技)；洋川芎內酯I(Senkyunolide I,SK I)、Z-藁本內酯(Z-Ligustilide,Z-Lig)(純度≥ 98%，上海麥克林生化科技)；其他試劑均為市售分析純。

1.2 藥材與細胞

200批當歸藥材購自甘肅隴西當歸藥材市場，經甘肅數字本草檢驗中心王浩亮工程師鑒定為傘形科藥材當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels。人胚腎上皮細胞293T細胞系(HEK 293T)購于北京博奧派克生物科技(批號:SL401)。

1.3 實驗方法

1.3.1 當歸提取物的制備取當歸藥材，粉碎，過100目篩得當歸粉末。稱取0.5 g加入50 mL 70%(7∶3，體積比)甲醇水溶液，25 ℃超聲30 min，離心取上清，經0.22 μm微孔濾膜過濾，收集續濾液，用于高效液相色譜(UPLC)分析。取500 μL剩余續濾液于96孔深孔板中，真空干燥后，-20 ℃保存備用。

1.3.2 UPLC/Q-TOF測定參照文獻方法對當歸提取物進行分析測定[14-15]。流出液經10∶1分流，其中1/10部分直接進行質譜檢測，另外9/10部分每間隔30 s收集至96孔深孔板中，真空干燥，得UPLC餾分。

1.3.3 基于雙熒光報告基因的NF-κB抑制活性檢測將HEK 293T細胞置于96孔板中，于37 ℃，5% CO2培養箱中靜置培養，待細胞融合度為70%時，分別加入NF-κB熒光素酶報告基因質粒pGL 4.32(100 ng/孔)、內參Renilla(9.6 ng/孔)和轉染試劑PEI(1 mg/mL)進行瞬時共轉染。20 h后細胞給藥，實驗分對照組(Con)、模型組(Mod，10 ng/mL TNF-α)、陽性藥組(Dex，10-5mol/L地塞米松)和當歸提取物組(10-4、10-5、10-6g/mL)，以及不同濃度(10-4、10-5、10-6mol/L)抑制劑對照品組(綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯I、Z-藁本內酯、歐當歸內酯A)、混合對照品組(Mixed standard,MS)(0.06 mg綠原酸+0.14 mg洋川芎內酯I+1.21 mg Z-藁本內酯溶于1 mL二甲基亞砜)、UPLC餾分組以及50批當歸提取物組(10 mg/mL)。給藥6 h后，收集細胞，按照熒光素酶報告基因試劑盒的說明測定熒光強度值，并計算NF-κB相對抑制活性(熒光比率=NF-κB熒光值/Renilla熒光值)。

1.3.4 UPLC含量測定參照文獻液相條件進行UPLC定量分析[14]。以綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯I、Z-藁本內酯、歐當歸內酯A對照品為對照，分別繪制標準曲線，并計算相應含量。

1.3.5 近紅外光譜法檢測采用布魯克傅里葉變換近紅外光譜儀，參照文獻方法[14]對當歸樣品進行紅外光譜掃描。選擇其中50批活性成分差異較大的樣品光譜以及對應Q-marker的UPLC含量測定結果，運用OPUS 7.0軟件進行定量建模，分別建立近紅外光譜快速檢測方法。

1.3.6 藥效成分含量與NF-κB抑制活性的擬合與應用為了建立Q-marker含量、綠原酸(X1)、阿魏酸(X2)、洋川芎內酯I(X3)、Z-藁本內酯(X4)、歐當歸內酯A(X5)與當歸NF-κB抑制活性(Y)之間的函數關系，依據樣本數是變量數5倍的原則[16]，選取25批當歸樣品，采用SIMCA(12.0)軟件進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)建模，獲得“量-效”關聯擬合函數。同時，另選取9批當歸樣品對所建模型進行驗證，建立擬合函數方程。利用所建立的擬合函數，將近紅外光譜法所測藥材中Q-marker的含量導入擬合函數中計算Y值，通過Y值來綜合預測藥材的抗炎活性。

2 結果與討論

2.1 當歸中NF-κB抑制成分的譜效篩選

采用UPLC/Q-TOF譜效篩選方法對當歸提取物中的NF-κB抑制成分進行篩選與鑒定。結果如圖1A～C所示，當歸提取物中的各成分在UPLC的UV檢測及質譜檢測(BPI)中得到較好分離。收集各時間段餾分進行抑制活性檢測，發現2.5、3.5、5、9、12 min餾分處顯示了明顯的NF-κB抑制效果(圖1D)，經質譜解析及對照品指認(圖1E)，確認其分別為綠原酸(m/z353.087 3[M-H]-)、阿魏酸(m/z193.053 3[M-H]-)、洋川芎內酯I(m/z207.102 1[M+H-H2O]+)、Z-藁本內酯(m/z191.107 5[M+H]+)和歐當歸內酯A(m/z381.207 9[M+H]+)，初步確認了潛在的Q-marker。

圖1 當歸藥材中NF-κB抑制活性成分的UPLC/Q-TOF譜效篩選Fig.1 UPLC/Q-TOF combined with NF-κB inhibitory activity screening for ASA.UPLC chromatogram of AS extractive;B.BPI in positive mode;C.BPI in negative model;D.UPLC combine with NF-κB inhibitory activity screening;E.UPLC for mixed reference substances；1.CA,2.FA,3.SK I,4.Z-Lig,5.Lev A；compare with Mod group,*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;compare with Con group,###p<0.001;(x± s,n = 4)

2.2 NF-κB抑制成分的驗證及含量測定

分別取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯I、Z-藁本內酯、歐當歸內酯A的對照品，依據上述NF-κB抑制活性檢測方法對其活性進行驗證。結果如圖2所示，所篩選出的5種成分均能劑量依賴地抑制由TNF-α誘導的NF-κB的表達(圖2)，驗證了該5種成分均具有NF-κB抑制活性。同時，選取50批當歸樣品，以UPLC檢測上述各活性成分的含量。其中，綠原酸的含量范圍為0.106 1～1.054 mg/g，均值為0.251 6 mg/g；阿魏酸的含量范圍為0.193 4～0.744 2 mg/g，均值為0.526 9 mg/g；洋川芎內酯I的含量范圍為0.080 8～1.911 mg/g，均值為0.841 3 mg/g；Z-藁本內酯的含量范圍為2.248～12.30 mg/g，均值為5.853 mg/g；歐當歸內酯A的含量范圍為0.110 5～0.760 7 mg/g，均值為0.301 5 mg/g。

圖2 當歸藥材中5種NF-κB抑制活性成分的評價Fig.2 Evaluation of 5 NF-κB inhibitory activity of AS compare with Mod group,*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;compare with Con group,###p<0.001;(x±s,n=5)

2.3 當歸NF-κB抑制活性與含量的關系擬合

2.4 當歸抗炎Q-marker的近紅外光譜擬合

采用交叉驗證的方法，分別對光譜預處理方法、光譜區段的選擇進行優化。以相關系數(R2)、交叉驗證均方差(RMSECV)以及相對分析誤差(RPD)為評價指標，對模型預測性能進行評判。其中RMSECV越小，R2越接近1，模型的準確度及預測效果越好；RPD>3.0，則認為所建模型具有較高可靠性，可用于后續分析[17-18]。

2.4.1 光譜預處理方法的選擇采用合適的光譜預處理方法對原始光譜進行處理，可減小光譜基線漂移，增強光譜的差異性，有利于特征信息的提取。本研究分別采用一階導數、二階導數、消除常數偏移量(ECO)、多元散射校正(MSC)、正態變量校正(SNV)等方法對50批當歸樣品的原始光譜(圖4A)進行預處理。結果如圖4B～D所示，優選后的預處理方法分別為：綠原酸采用一階導數+SNV，洋川芎內酯I采用ECO，Z-藁本內酯采用MSC。

圖3 當歸NF-κB抑制活性與Q-marker含量的關系擬合Fig.3 The fitting relationship between NF-κB inhibitory activity and Q-marker content of AS A.VIP plot;B.S-plot;C.NF-κB inhibitory activity for 25 batches of AS;D.regression trend of true value and predicted value;E.equivalence verification(x±s,n=3,ns:not significant)

2.4.2 光譜區間以及主因子數的確定為了提高近紅外光譜擬合的準確性，進一步對上述3種Q-marker的最佳波數區間進行篩選和優化，并確定其最佳建模區間：綠原酸為7 502.8～6 098.7 cm-1及5 450.6～4 598.1 cm-1區段，洋川芎內酯為9 400.7～7 498.9 cm-1及6 102.5～5 774.6 cm-1區段，Z-藁本內酯為7 502.8～5 446.8 cm-1及4 602～4 247.1 cm-1區段。所選最佳波段區間有效提取了光譜差異信息，較好地屏蔽了噪音等不良信號的干擾。同時，為了確保模型預測的穩健性，對建模的最佳主因子數進行了考察。綜合模型R2、RMSECV和RPD的檢測結果，最終確定建模的主因子數，綠原酸為13，洋川芎內酯I為7，Z-藁本內酯為12。綠原酸、Z-藁本內酯的主因子數相對洋川芎內酯I偏大說明其近紅外預測更為復雜。本研究基于建模效果，選擇較少的主因子數，在保障模型預測能力的同時兼顧了分析效率。

2.4.3 定量模型的建立以“2.3”部分的50批當歸樣品作為樣本集，根據上述UPLC的含量測定結果，采用交叉檢驗模式，選用最佳光譜預處理方法、波數區間以及主因子數，通過偏最小二乘法進行建模，得到3種Q-marker的定量模型。結果如圖4E～G所示，NIRS模型預測值與UPLC測定值表現出良好的線性關系，模型擬合能力良好，R2、RMSECV及RPD均可以滿足預測要求。

2.5 當歸藥材抗炎活性的快速評價

本文嘗試基于Q-marker的含量搭建近紅外光譜技術與抗炎活性之間的關系。首先，依據上述所建立的近紅外定量模型，分別對另外的150批當歸藥材中的3種Q-marker含量進行測定。得到綠原酸的含量范圍為0.111 4～1.032 mg/g，均值為0.524 1 mg/g(圖5A)；洋川芎內酯I的含量范圍為0.096 8～1.341 mg/g，均值為0.624 5 mg/g(圖5B)；Z-藁本內酯的含量范圍為2.300～12.23 mg/g，均值為4.850 mg/g(圖5C)。將獲得的含量測定結果分別導入上述NF-κB抑制活性預測的擬合方程，獲得相應抗炎活性的預測Y值，最終通過近紅外光譜整合“量-效”關聯擬合分析，實現了對當歸藥材抗炎功效的快速、精準評價(圖5D)。

圖4 當歸藥材中3種Q-marker的近紅外光譜分析Fig.4 NIR spectroscopy analysis for three Q-markers of ASA.original spectra;B,C and D.pre-processed spectra for CA,SK I and Z-Lig,respectively;E,F and G .quantitative model of CA,SK I and Z-Lig,respectively

3 結 論

本研究采用UPLC/Q-TOF技術結合NF-κB雙熒光素酶報告基因譜效篩選方法，對當歸藥材中具有NF-κB抑制作用的Q-marker成分進行了篩選、鑒定與評價，確認綠原酸、洋川芎內酯I、Z-藁本內酯為當歸發揮抗炎作用的關鍵Q-marker。并通過近紅外光譜技術建立了上述Q-marker成分的快速檢測方法。此外還運用化學計量學手段，建立了Q-marker成分含量與整體抗炎功效的擬合關系函數，最終實現了以Q-marker為核心，通過近紅外光譜掃描對當歸抗炎功效的快速評價，為當歸藥材品質的快速評價與監管提供了創新方法。