13種多酚類異構(gòu)體的超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

賀光云, 侯 雪*, 韓 梅, 邱世婷, 李 瑩, 張思林, 陳 西

[1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測(cè)試中心，四川 成都 610066； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(成都)，四川 成都 610066；3. 綿陽市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 綿陽 621000； 4. SCIEX中國(guó)，上海 200335]

多酚類化合物是多羥基酚類化合物及其衍生物的總稱，是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于多種植物的皮、根、葉、果中，如茶多酚、蘋果多酚、葡萄多酚、石榴皮多酚等[1]。茶多酚(TP， Tea polyphenols)又名茶鞣質(zhì)，主要包括兒茶素、黃酮、花青素和酚酸四類約三十多種[3]，具有抗氧化、抗衰老、降血脂、防癌抗癌、抗骨質(zhì)疏松、抗炎抑菌、抗放射損傷以及減肥等生理功效和藥理作用[2-3]。茶多酚是茶葉中的主要功能成分，是茶中苦味、澀味和色澤的重要來源，是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，其在茶葉中的含量較高，約占干物質(zhì)總量的15%以上，有的品種甚至高達(dá)40%[4]。茶葉中茶多酚的快速篩查及定量分析對(duì)茶葉的品質(zhì)鑒定具有重要作用。

多酚類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，部分化合物具有多個(gè)構(gòu)造異構(gòu)或手性異構(gòu)體。這些異構(gòu)體通常結(jié)構(gòu)相近、理化性質(zhì)相似，尤其是官能團(tuán)位置異構(gòu)和立體異構(gòu)體，在色譜中往往具有相同的保留時(shí)間，在質(zhì)譜中產(chǎn)生相同的母離子甚至相同的子離子，通常很難對(duì)其進(jìn)行有效的分離鑒定[5--6]。大量的同分異構(gòu)體分析物是色譜分析中的巨大挑戰(zhàn)，因此研究同分異構(gòu)體的分離分析具有重要意義。有關(guān)同分異構(gòu)體的分離研究中，采用超臨界流體色譜法[7]、手性色譜柱[8]、高速逆流色譜[9]、離子淌度質(zhì)譜[10]以及借助各種新型材料[11-12]的研究較多，而通過普通液相色譜進(jìn)行異構(gòu)體，尤其是多酚類化合物異構(gòu)體的研究則鮮有報(bào)道。綠原酸類物質(zhì)廣泛存在于茶葉、咖啡、金銀花及枸杞葉等植物中，具有抗氧化、抗炎癥、抗痙攣、抗病毒及抑制致癌物質(zhì)誘變等功效[13]，近年來廣受研究人員關(guān)注。董珊等[14]建立了同時(shí)測(cè)定茶葉、枸杞葉、地瓜葉、咖啡、金銀花中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C含量的高效液相色譜法，采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，乙腈-0.1%甲酸溶液流動(dòng)相，梯度洗脫。易小麗等[15]采用高效液相色譜法測(cè)定煙葉中的綠原酸及其異構(gòu)體，以Diamonsil plus C18色譜柱為固定相，甲醇和乙酸/水(1/99)為流動(dòng)相，經(jīng)梯度洗脫使綠原酸及其異構(gòu)體得到分離，并采用紫外檢測(cè)器對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)。吳國(guó)利等[16]建立了同時(shí)測(cè)定植物飲料中7種綠原酸單體含量的高效液相色譜法，采用乙腈-三氟乙酸-水作為流動(dòng)相，通過梯度洗脫，將7種單體進(jìn)行分離。以上研究大多是對(duì)單組異構(gòu)體的分析檢測(cè)，而對(duì)多個(gè)異構(gòu)體同時(shí)分析的研究報(bào)道較為少見。

本課題組多年來致力于茶葉的營(yíng)養(yǎng)成分和質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究。本研究在課題組前期研究工作基礎(chǔ)上[17-18]，建立了多個(gè)多酚類異構(gòu)體(Chart 1)的UPLC-QTOF-MS分析方法。采用Kinetex 2.6μm Biphenyl色譜柱，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇/乙腈(30/70)，通過梯度洗脫程序，在負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，實(shí)現(xiàn)了多個(gè)酚類異構(gòu)體的有效色譜分離及高分辨質(zhì)譜分析。并將建立的UPLC-QTOF分析方法應(yīng)用于桑葉茶和3種綠茶中該類多酚類化合物的篩查，檢測(cè)到綠原酸及其異構(gòu)體和山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷等7種組分。該方法涉及異構(gòu)體5組共13個(gè)，A組：木犀草素(A1)、山奈酚(A2)、漆黃素(A3)， B組：櫻花素(B1)和異櫻花素(B2)， C組：隱綠原酸(C1)、新綠原酸(C2)、綠原酸(C3)，C組：山萘酚-7-O-葡萄糖苷(D1)、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷(D2)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(D3)， D組：橙皮甙(E1)和新橙皮苷(E21)。該方法也可用于茶多酚等植物多酚或有機(jī)合成多酚類化合物的快速篩查及定性定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Nexera X2型超高效液相色譜儀，日本島津公司；SCIEX TripleTOF? 5600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，美國(guó)SCIEX公司；WH-3微型渦旋混合儀，上海路西分析儀器有限公司。

Chart 1

13種多酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，PhytoLab GmbH & Co. KG；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司；綠茶樣品，四川省文君茶葉有限公司和四川省花秋茶業(yè)有限公司；綠脈牌桑葉茶，成都世煌生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取多酚標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制濃度為400 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃儲(chǔ)存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確量取儲(chǔ)備液各1.0 mL，用甲醇稀釋定容至50 mL，配制8.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-18 ℃下保存，備用。

上機(jī)樣品：取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液50 μL，加入10%甲醇水溶液950 μL稀釋為0.4 mg·L-1，過0.22 μm膜上機(jī)。

1.3 樣品提取

稱取一定量茶葉(桑葉茶：一袋2.0 g， 3種綠茶各2.0 g)，分別置于500 mL燒瓶中，加入300 mL沸水，浸泡30 min；傾倒出上清液，再加入300 mL沸水浸泡，重復(fù)提取3次。合并提取液，取1 mL茶湯過0.22 μm膜上機(jī)檢測(cè)。

1.4 儀器條件

色譜條件： Kinetex 2.6 μm Biphenyl色譜柱(2.1 mm×100 mm， 100 ?)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇/乙腈(30/70)；流速：0.45 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：45 ℃。梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min， 5%B； 5～7 min， 5%B→25%B； 7～14min， 25%B→50%B； 14～15 min， 50%B→90%B； 16.1～18 min， 5%B。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Analyst 1.7.1和Peak View 2.2軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

為獲得對(duì)多組異構(gòu)體的最佳分離條件，分別考察不同色譜柱的分離性能，包括Shim-pack XR-ODS Ⅲ柱(2.0 mm×150 mm, 2.2 μm，柱-1)、 CAPCELL PKA-C18柱(2.1 mm×100 mm， 2 μm，柱-2)、 Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm， 1.7μm，柱-3)、 Kinetex C18柱(2.1 mm×100 mm， 100 ?，柱-4)和Kinetex Biphenyl(2.6 μm)柱(2.1 mm×100 mm， 100 ?，柱-5)，提取離子流色譜圖分別見圖1～圖4。

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Time/min圖1不同色譜柱對(duì)A組異構(gòu)體的提取離子流色譜圖

由圖1～圖4可以看出，在柱-1～4上，5組異構(gòu)體均未能同時(shí)實(shí)現(xiàn)有效分離。A組、C組和D組異構(gòu)體在柱-2上分離效果較好，但B組和E組異構(gòu)體未達(dá)到基線分離。在柱-3上，A組、C組和E組異構(gòu)體分離較好，而B組幾乎無分離，D組中D2和D3也未達(dá)到基線分離。柱-4分離效果更差，A組異構(gòu)體色譜峰拖尾嚴(yán)重，C組和D組均未達(dá)到良好分離。對(duì)于該類多酚類異構(gòu)體來說，最不適宜的是柱-1，分離效果差，且部分組分未能檢測(cè)到信號(hào)峰。

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研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于文中涉及的多酚類異構(gòu)體，分離效果較好的是柱-3和柱-5。值得一提的是，對(duì)于C組，即綠原酸組異構(gòu)體和E組橙皮苷異構(gòu)體的分離，柱-3是最佳選擇，其響應(yīng)高、峰型好，而且異構(gòu)體的保留時(shí)間差異較大(圖5)，分離效果較柱-5更勝一籌。因此，針對(duì)分析物中綠原酸類和橙皮苷類異構(gòu)體的分析研究可優(yōu)先選擇柱-3。而對(duì)于B組異構(gòu)體櫻花素和異櫻花素，除柱-5外，在其他4根色譜柱，即使調(diào)節(jié)流動(dòng)相配比及酸堿、以及優(yōu)化梯度均不能實(shí)現(xiàn)有效分離，因此對(duì)該組異構(gòu)體的分析柱-5是最佳選擇。

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不同色譜柱分離效果的差異主要是由于色譜柱固定相與待測(cè)物保留特征不同。普通C18柱和待測(cè)物間主要靠疏水作用而獲得保留，單一的疏水作用機(jī)制使其對(duì)強(qiáng)極性樣品，如芳香酸類物質(zhì)的保留時(shí)間過短，導(dǎo)致分離效果不理想；而苯基柱中，固定相和待測(cè)物間不僅具有疏水作用，還有π-π電子作用，對(duì)于具有共軛體系的化合物來說，選擇性更強(qiáng)[19]。

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綜上所述，最適于本文考察的5類異構(gòu)體同時(shí)分離檢測(cè)的是Kinetex Biphenyl柱(柱-5)，圖6為其提取離子流圖。可以看出，雖然該色譜柱對(duì)綠原酸的分離不夠理想，但足以實(shí)現(xiàn)定性和定量分析。此外，由于隱綠原酸和綠原酸的二級(jí)特征離子不同，分別為m/z135.0450和m/z85.0292，采用二級(jí)離子進(jìn)行定量，可完全排除色譜峰不完全分離對(duì)定量分析造成的影響。因此，本研究選擇Kinetex Biphenyl色譜柱進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

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表 1 13種多酚的保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

采用Kinetex Biphenyl色譜柱，進(jìn)一步考察不同流動(dòng)相體系對(duì)樣品分離及質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)的影響。首先考察水相，以甲醇為有機(jī)相，分別以0.1%氨水溶液、純水和0.1%甲酸為水相。一般情況下負(fù)離子模式下采用純水或氨水溶液作為流動(dòng)相，有助于待測(cè)物的電離[20]。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水相為0.1%氨水溶液或純水時(shí)，色譜分離不好，峰型較差，有明顯的拖尾現(xiàn)象，質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)也較弱。甲酸由于提供氫離子，一般會(huì)抑制負(fù)離子化合物的電離，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇0.1%甲酸作為水相時(shí)，峰型拖尾現(xiàn)象得到明顯改善，分離度得到提高，因此本實(shí)驗(yàn)以0.1%甲酸為水相。

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察有機(jī)相的影響，分別以甲醇、乙腈以及不同配比的甲醇/乙腈體系為有機(jī)相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲醇體系有利于櫻花素和異櫻花素(B組)的分離，由于櫻花素和異櫻花素結(jié)構(gòu)極其相似，而甲醇可增加櫻花素和異櫻花素在苯基固定相的π-π電子作用，致使兩者在固定相上保留時(shí)間不同，從而被分離[19]。而乙腈體系有助于分離橙皮苷和新橙皮苷(E組)，但甲醇和乙腈體系均無法使研究的5對(duì)異構(gòu)體達(dá)到同時(shí)分離的效果。異構(gòu)體在質(zhì)譜中常常產(chǎn)生相同的分子離子峰，甚至由此產(chǎn)生的子離子也相同，如B組異構(gòu)體中的隱綠原酸和新綠原酸，在質(zhì)譜中產(chǎn)生相同的特征碎片離子m/z135.0450， B組異構(gòu)體中三個(gè)化合物的子離子均為m/z285.0405， D組異構(gòu)體橙皮甙和新橙皮苷的子離子峰同為m/z301.0723。進(jìn)一步，為了實(shí)現(xiàn)在質(zhì)譜分析中多種組分同時(shí)檢測(cè)，考察混合有機(jī)體系甲醇/乙腈不同配比(V/V， 70/30、 60/40、 50/50及30/70)的分離效果。結(jié)果表明，以甲醇/乙腈(V/V=30/70)為有機(jī)相時(shí)，通過梯度洗脫程序可實(shí)現(xiàn)5組異構(gòu)體的同時(shí)分離，保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 2 篩查結(jié)果判定匯總表

2.3 方法應(yīng)用

采用建立的UPLC-QTOF分析方法分別對(duì)桑葉茶和綠茶進(jìn)行篩查分析，結(jié)果見表2。根據(jù)母離子的精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、同位素分布匹配指數(shù)以及數(shù)據(jù)庫匹配情況進(jìn)行判斷。設(shè)定母離子精確質(zhì)量數(shù)的允許偏差范圍<5 ppm，保留時(shí)間偏差范圍<10%，同位素分布匹配指數(shù)>80，數(shù)據(jù)庫匹配得分>70，判定為陽性樣品。

由表2可以看出，在13種目標(biāo)多酚中，共篩查到7種成分，即A1、A2、C1～C3、D2和D3，其中，桑葉茶中顯示有C1、C2、C3和D2的存在。3種綠茶篩查結(jié)果相近，綠茶①檢測(cè)到目標(biāo)成分最多，為7種，其余兩種綠茶篩查結(jié)果相同，共檢測(cè)到6種目標(biāo)多酚。可以看出，綠原酸及其異構(gòu)體和山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷廣泛存在于測(cè)試茶葉中，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。

建立了5組多酚類異構(gòu)體的UPLC-QTOF-MS分析方法。最優(yōu)色譜條件為：采用Kinetex 2.6 μm Biphenyl色譜柱，以0.1%甲酸水溶液(V/V)-甲醇/乙腈(V/V=30/70)為流動(dòng)相，梯度洗脫，在負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描采集。該研究涉及山奈酚、櫻花素、綠原酸、橙皮甙及其異構(gòu)體共13種化合物。將建立的UPLC-QTOF-MS分析方法應(yīng)用于桑葉茶和3種綠茶中該類多酚類化合物的篩查，結(jié)果顯示綠原酸及其異構(gòu)體和山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷在綠茶中的廣泛存在。該方法還可用于其它植物多酚或合成多酚類化合物的快速篩查及定性定量分析，具有較好的實(shí)用價(jià)值。