基于細胞凋亡探討搜風祛痰方對心肌缺血再灌注大鼠冠脈微循環的影響*

金頌峰 宮麗鴻 肖福龍 呂 童

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110079；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032）

近年來，由于急性冠脈綜合征入院的患者中，約40%其冠脈造影結果未見明顯異常，這與心外膜冠狀動脈無狹窄被認為不存在缺血的觀點不相吻合，說明可能存在著冠脈微循環障礙（CMD）［1］。有充分證據說明，心肌缺血再灌注損傷中存在著血管內皮細胞凋亡［2］，且細胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷呈正比，這是造成血管內皮功能障礙［3］，導致CMD發生的主要原因［4］。如何減少心肌細胞凋亡已成為心肌保護的研究熱點之一。前期研究結果表明［5-6］搜風祛痰方具有保護血管內皮功能的作用。因此，本研究將基于該結論進一步探討搜風祛痰方對大鼠心肌缺血再灌注損傷冠脈微循環內皮細胞凋亡的影響，明確搜風祛痰方保護血管內皮功能進而治療CMD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠140只，8周齡，體質量（240±20）g，編號：21000092018010［長生生物，許可證號：SYXK（遼）2013-0009］。遼寧中醫藥大學動物實驗中心飼養，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，每日光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 實驗藥物 搜風祛痰方：蜈蚣1條，全蝎5 g，白術15 g，水蛭15 g，陳皮15 g，地龍20 g，法半夏15 g。由遼寧省中醫院制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液。培哚普利片（施維雅制藥，國藥準字號：H20034053，4 mg/片）。

1.3 試劑與儀器 前列環素（PGI2）、血栓素A2（TXA2）試劑盒（AMEKO）；4%多聚甲醛固定液（碧云天生物，P0099-100mL）；柱式RNA提取試劑盒（生工生物）；反轉錄試劑盒（諾唯贊）；微量核酸蛋白測定儀（柏點）；PCR擴增儀（賽默飛）；高通量組織研磨儀（萊馳，型號：MM400）；小動物呼吸機（HX-100E型號，成都泰盟科技有限公司）；熒光定量PCR儀（Agilent Technologies）。

1.4 分組與給藥 適應性喂養大鼠7 d，隨機分為4組：假手術組、模型組、西藥組、中藥組，每組35只。假手術組、模型組給予10 mL/kg生理鹽水，中藥組（依照前期研究結果［5］）給予8.1 g/kg搜風祛痰方，西藥組給予0.4 mg/kg培哚普利片，連續灌胃7 d。

1.5 造模方法 參考文獻［7］方法，末次灌胃1 h后，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠。插入電極監測心電圖，置入氣管導管，接呼吸機。剃毛消毒大鼠左側胸壁，將第三四肋間皮膚橫切口切開，使心臟充分暴露。在左心耳下距根部2～3 mm處結扎左前降支及少量心肌組織，閉合胸腔。結扎成功后可見心電圖R波增寬、ST段抬高。缺血30 min后剪開結扎線，再灌注120 min。造模成功的標志為抬高的ST段下降1/2以上。假手術組與其他3組手術過程相同，但不結扎。

1.6 標本采集與檢測 采集前夜大鼠需禁食。通過腹主動脈取血，靜置離心，取上清液，在-20℃中保存。將大鼠立即處死，無菌環境摘取心臟，由4%多聚甲醛固定后放入液氮中，-20℃凍存。1）心電圖。麻醉大鼠，仰臥固定，插入電極，在缺血及再灌注時進行監測。2）ELISA法測定PGI2、TXA2含量。3）RT-PCR法測Bax mRNA、Bcl-2 mRNA。提取總RNA后反轉錄合成cDNA，構建熒光PCR反應體系，進行擴增反應。Bax引物序列為上游為5′-GGGCCTTTTTGCTACAGG GT-3′，下游為 5′-TTCTTGGTGGATGCGTCCTG-3′，長度為106 bp。Bcl-2引物序列為上游為5′-GGATCCAGGATAACGGAGGC-3′，下游為 5′-ATGCACCCAGAGTGATGCAG-3′，長度為141 bp。

1.7 統計學處理 應用SPSS20.0軟件。計量資料以（）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 共成功建立模型大鼠42只，其中模型組16只，西藥組12只，中藥組14只。假手術組大鼠25只。

2.2 各組大鼠PGI2、TXA2含量比較 見表1。相比假手術組，模型組TXA2含量增加，PGI2含量減少（P＜0.05）；相比模型組，西藥組和中藥組PGI2含量升高，TXA2含量下降（P＜0.05）。

表1 各組大鼠PGI2、TXA2含量比較（ng/L，±s）

表1 各組大鼠PGI2、TXA2含量比較（ng/L，±s）

與假手術組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

n組別假手術組模型組西藥組中藥組25 16 12 14 PGI2 68.484±1.950 32.440±1.918▲58.257±5.934△54.507±5.351△TXA2 35.141±0.711 62.258±5.785▲42.471±1.012△49.514±3.426△

2.3 各組大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達比較 見表2。相比假手術組，模型組Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達均升高（P＜0.05）；相比模型組，西藥組和中藥組Bcl-2 mRNA表達升高，Bax mRNA表達下降（P＜0.05）。

表2 各組大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達水平比較（±s）

組別假手術組模型組西藥組中藥組n 25 16 12 14 Bcl-2 mRNA 1.001±0.053 1.855±0.114▲3.594±0.571△3.618±0.224△Bax mRNA 1.008±0.160 3.006±0.290▲1.853±0.211△1.706±0.164△

3 討論

CMD是指在各種致病因素的作用下冠脈微血管的固有結構及功能出現異常，引發心肌細胞灌注不足而出現以心肌缺血為主要癥狀的一種臨床綜合征［8］。該病涉及人群廣泛，其發病可引起冠心病不良事件的發生，并影響其發展、治療和預后，從而導致急性心血管事件的發生甚至引起死亡［9］。研究發現［10］，導致CMD發生的原因有血管內皮功能障礙、炎癥反應、氧化應激等方面，其中由血管內皮功能障礙所引起的CMD最為常見。近年來，心肌缺血再灌注損傷中的細胞凋亡所引起的血管內皮功能障礙已被越來越多的實驗所證明［11］。因此，從抑制細胞凋亡的角度保護血管內皮功能是保證冠脈微循環穩定、治療CMD不可替代的基礎。

根據CMD的臨床表現，可將其歸屬為中醫學“胸痹”范疇。現代人嗜食肥甘，導致脾氣虛弱，健運失施，水濕內阻，聚濕生痰。痰凝可致血瘀，二者膠結而生內熱，進而熱盛風動，導致脈絡絀急，這就與CMD血管栓塞痙攣的發病機制相似［5］。故治以搜風祛痰方，作搜內風、消痰瘀、通脈絡之用。方中全蝎、蜈蚣與地龍共為君藥，可清熱息風鎮痙、通絡散結；陳皮、半夏與白術共為臣藥，可燥濕化痰、寬胸散結；水蛭為佐藥，可破血消瘀通絡。全方共奏搜風祛痰、祛瘀通絡之效。藥理方面，全蝎、蜈蚣與地龍具有保護內皮、抗凝、改善血運等功能［12-14］；陳皮、半夏與白術具有抗炎、抗血栓、抗心律失常和抗氧化等功效［15-17］；水蛭具有抗凋亡、預防血栓等功效［18］。

培哚普利片具有持續時間長、耐受性好、無不良影響等優點，可擴張血管、加快修復病變小動脈、減少血容量、降低血管阻力，有效改善血流動力學［19］，故選用其為本實驗陽性對照藥物。Bcl-2和Bax是目前公認的一對調控凋亡的關鍵基因［20］。心肌缺血再灌注損傷時，Bax通過降低Bcl-2表達并升高細胞內Ca2+，導致細胞凋亡；而Bcl-2則通過抗氧化劑或抑制氧自由基生成，改變細胞內Ca2+外流，調節細胞內cGMP含量，抑制細胞凋亡［21］。研究發現［22］，Bcl-2和Bax含量的增高與缺血再灌注過程中心肌細胞的反應性表達、提高細胞內在抵抗力相關。本實驗結果顯示：相比假手術組，模型組Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達上升。說明心肌缺血再灌注損傷時出現細胞凋亡；相比模型組，中藥組Bcl-2 mRNA表達上升，Bax mRNA表達降低。說明搜風祛痰方具有抑制大鼠心肌缺血再灌注損傷冠脈微循環內皮細胞凋亡的作用。PGI2與TXA2是一對具有調控血管舒縮與血小板聚集作用的相互拮抗的前列腺素因子，由血管內皮細胞分泌［23］。因此，PGI2和TXA2的不平衡與冠脈微循環內皮功能障礙的發生有密切關系。本實驗結果顯示：相比假手術組，模型組PGI2含量下降，TXA2含量上升。說明心肌缺血再灌注損傷發生時出現冠脈微循環內皮功能障礙；相比模型組，中藥組TXA2含量明顯降低，PGI2含量明顯升高。說明搜風祛痰方可有效調節血管收舒平衡，保護內皮功能。

綜上所述，搜風祛痰方可上調Bcl-2 mRNA表達，下調Bax mRNA表達，調節PGI2與TXA2的含量，通過抑制血管內皮細胞的凋亡保護大鼠心肌缺血再灌注冠脈微循環內皮功能，實現對CMD的治療作用。