冷鮮雞貨架期微生物預測系統的構建

瞿 洋周昌艷索玉娟張東來韓奕奕豐東升楊曉君李苗云

(1. 上海市農業科學院農產品質量安全與檢測技術研究所，上海 201403；2. 上海市農產品質量安全中心，上海 201708；3. 河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002)

貨架期是指推薦條件下食品保持理想品質的時間長度[1]。微生物活動是影響肉品貨架期的主要因素，微生物學方法是預測貨架期的常用方法[2]。利用該方法進行貨架期預測時，使用何種微生物參數存在一定的爭議。研究認為，測定某種優勢腐敗菌是一種重要手段[3-5]，其中腸桿菌、假單胞菌和熱死環絲菌是引起雞肉腐敗變質的常見微生物[6-8]。與假單胞菌相比，腸桿菌能產生與之相同的引起肉品風味變化的揮發性物質[9]，且在雞肉產品中含量更高[10]，所以是雞肉產品低溫貯藏時比假單胞菌更重要的腐敗菌。熱死環絲菌在有氧條件下產生丙酮、雙乙酰，無氧條件下產生乳酸、乙醇等揮發性化合物[11]，是無氧及微需氧環境中的優勢腐敗菌。也有研究[12-15]認為，不同食品中優勢腐敗菌的種類和數量存在一定差異，不同微生物間的相互作用會影響腐敗的進程，以單一菌種作為建模對象預測貨架期不具有代表性，建議選擇菌落總數為研究對象進行貨架期預測。

目前，貨架期預測手段主要以數學方法為主，且需通過用戶自我計算來獲得貨架期信息，缺乏直觀性。李苗云等[3]描述了假單胞菌在雞胸肉上的生長，確定了生鮮雞的貨架期；董颯爽等[12]測定了菌落總數，并建立了雞胸肉產品的貨架期。ComBase是能在線預測微生物生長的預測微生物學信息數據庫，但仍需人工計算貨架期，無法直觀展示其貨架期信息。因此，研究擬選用腸桿菌、熱死環絲菌和菌落總數為微生物參數，建立冷鮮雞貨架期動力學模型，并采用皮爾森相關分析比較上述3個微生物參數與貨架期預測準確度的相關性，利用Visual Basic語言編寫形成冷鮮雞貨架期微生物預測系統，并對該系統進行實際樣品驗證，旨在實現計算機后臺承擔貨架期公式計算過程，使不具備微生物預測學背景的用戶僅輸入初始微生物數量和貯藏時間，即可獲得當前冷鮮雞貨架期數值，達到簡化預測模型應用的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

冷鮮雞：構建模型用，上海圣華食品銷售公司；

冷鮮雞：實際樣品驗證，市售；

結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基(VRBGA)、平板計數瓊脂培養基(PCA)：廣東環凱微生物科技有限公司；

STAA瓊脂培養基及添加劑：青島海博生物技術有限公司；

PBS：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

高壓滅菌鍋：SX-500型，日本Tomy Digital Biology公司；

生物安全柜：1300 SERIES A2型，美國Thermo公司；

恒溫培養箱：Medcenter Einrichtungen GmbH型，德國Friocell公司；

恒溫振蕩培養箱：TQZ-312型，上海精宏實驗設備有限公司；

電子天平：AL104型，瑞士Mettler Toledo公司；

漩渦混勻儀：Vortex Genie 2型，美國Scientific Industries公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 無菌條件下分割冷鮮雞，取雞腿跟雞胸肉于無菌均質袋中，參照文獻[3]，分別于5，10，15，20，25 ℃恒溫培養箱中貯藏192，120，72，55，31 h，每隔一定時間取出1份樣品(1只雞腿、1份雞胸肉)。

1.2.2 感官評定 按GB 2707—2016執行，自然光照下，對雞肉樣品的色澤、黏度、氣味和彈性等方面進行綜合評價。

1.2.3 微生物參數測定 無菌操作剪取雞腿肉和雞胸肉樣品，混合后取25 g加入225 mL滅菌PBS中均質2 min，取均質液1 mL稀釋。按GB 4789.41—2016中的腸桿菌科平板計數法測定冷鮮雞中的腸桿菌，選用平板計數法在STAA瓊脂上測定冷鮮雞中的熱死環絲菌總數，按GB 4789.2—2016測定冷鮮雞中的菌落總數。每個溫度設置3組平行，不同溫度下測定終止時間以細菌生長達穩定期為準。

1.2.4 冷鮮雞貨架期的建立

(1) 微生物一級模型的建立：常用的一級模型有修正的Gompertz、Baranyi以及Logistic模型。修正的Gompertz模型是經典模擬，被廣泛應用于肉品致病菌以及腐敗菌的生長預測[2]。Logistic模型適合在生長環境和影響因素單一時使用，另外，兩種模型適用于復雜環境。修正的Gompertz和Baranyi模型均考慮了延滯期的影響，前者適用于低溫和適溫條件下微生物的生長，后者更適用于變溫環境[16-17]。試驗采用恒溫靜態法，用修正的Gompertz方程擬合冷鮮雞肉在不同溫度貯藏時的腸桿菌數、熱死環絲菌數及菌落總數，描述不同溫度條件下上述3種目標菌的生長動態[18]。修正的Gompertz方程如式(1) 所示。

(1)

式中：

N(t)——t時刻菌落數，CFU/g；

N0——初始菌落數，CFU/g；

Nmax——最大菌落數，CFU/g；

μmax——最大比生長速率，h-1；

λ——生長遲滯期，h。

(2) 微生物二級模型的建立：根據一級模型得到的冷鮮雞中腸桿菌、熱死環絲菌和細菌的最大比生長速率和遲滯期，選取平方根模型擬合其與溫度之間的生長關系，表達式如式(2)、(3)所示[19]。

(2)

(3)

式中：

μmax——最大比生長速率，h-1；

λ——生長遲滯期，h；

T——生長溫度，℃；

Tmin——最低生長溫度，℃；

a、b——模型參數。

(3) 冷鮮雞貨架期的建立：通過初始菌落數(N0)到最小腐敗量(Nt)所需要的增殖時間來進行預測。按式(4)計算貨架期。

(4)

(4) 模型的驗證：采用判定系數R2和均方根誤差(RMSE)評價一級模型，判定系數R2、偏差因子(Bf)和準確因子(Af)評價二級模型，Bf和Af評價貨架期模型[20]，相對誤差評價貨架期預測系統。R2用來對模型方程的擬合度進行評價，R2越接近1擬合度越高。RMSE可以用來衡量準確度和離散程度。Bf顯示了預測值與觀測值的偏差程度，Bf<1說明預測值小于觀測值，表示該模型處于一個合理的范圍。Af顯示了預測值與觀測值的準確度，Af>1且越接近1，說明預測值和觀測值越接近，準確度較高。

(5)

(6)

(7)

式中：

μpre——預測值；

μobs——相同時間下的實測值；

n——試驗次數。

(5) 冷鮮雞貨架期微生物預測系統：選用 Visual Basic(VB6 Mini)作為微生物生長預測程序編寫工具。

1.3 數據處理

腐敗閾值的各指標數據采用Excel 2007進行分析，微生物預測模型數據采用Origin 8.5軟件進行擬合，采用Excel 2007軟件繪圖，微生物參數與貨架期準確度的相關性采用Matlab進行分析。

2 結果與分析

2.1 冷鮮雞腐敗閾值的確定

由表1可知，當貯藏溫度為5 ℃時，雞肉在第4天開始出現腐敗現象，顏色由淡黃轉向橘黃，鮮紅轉向玫紅，且表面發黏，同時伴有異味，肉品整體呈次新鮮狀態；此時雞肉中腸桿菌、熱死環絲菌、菌落總數分別為4.433，2.735，5.141 lg(CFU/g)，將其確定為腐敗閾值。當菌落數值達到腐敗閾值時，會促使微生物產生酶的信號分子，從而加速肉品品質劣變[21]。雞肉腸桿菌的腐敗閾值與鄭夢林等[5]的結果接近；菌落總數腐敗閾值與高燦燦等[22]的結果相吻合，與董颯爽等[12]的結果相近。

表1 5 ℃時冷鮮雞的品質變化

2.2 冷鮮雞貨架期模型的建立

2.2.1 冷鮮雞貯藏期間一級模型的擬合 由圖1可知，雞肉腐敗過程中3種微生物參數呈不同的生長狀況。由表2可知，R2>0.97，說明修正的Gompertz方程能較好地擬合試驗中不同微生物參數的生長情況。隨著貯藏溫度的升高，微生物參數最大比生長速率升高，遲滯期變短。5 ℃時的最大比生長速率為0.02～0.03 h-1，25 ℃時>0.3 h-1；5 ℃時遲滯期為30～42 h，25 ℃時為4～5 h，說明貯藏溫度是影響微生物生長的關鍵因素，微生物的生長隨貯藏溫度的不同而發生顯著變化，體現了低溫貯藏的重要性，與已有研究[23-24]相符。此外，微生物間存在競爭關系，在各自適宜的生長溫度下，部分微生物快速生長，另一部分微生物的生長受到抑制。隨著貯藏溫度的升高，熱死環絲菌遲滯期的降幅顯著大于腸桿菌(P<0.05)，但其生長速率的增長程度小于腸桿菌。

2.2.2 冷鮮雞貯藏期間二級模型的擬合 由表3可知，貯藏溫度、生長速率及遲滯期的R2>0.94，呈良好的線性關系。根據Ross對偏差因子的劃分標準，若Bf為0.90～1.05，越靠近1.00，模型越可靠；若Bf為0.70～0.90或1.05～1.15，該模型也可以被接受[25]。腸桿菌、菌落總數及熱死環絲菌μmax的Bf均為0.94～1.06，λ的Bf為1.08～1.13，模型偏差度小。Af值應>1，越靠近1其準確度越高；Braun等[26]認為Af值為1.1～1.9時，模型均可接受。腸桿菌、熱死環絲菌及菌落總數Af為1.04～1.33，說明模型準確度高。

2.2.3 冷鮮雞貨架期模型的建立 由表4可知，腸桿菌、熱死環絲菌和菌落總數貨架期公式的Bf值為0.941 63～0.985 84，與李苗云等[3]建立的生鮮雞肉貨架期Bf值(0.999 99～1.000 52)相比，其偏差范圍較大，但屬于Ross偏差因子劃分標準的模型可靠類別；Af值為1.076 01～1.144 63，小于李苗云等[3]的結果(1.229 34～1.320 56)，說明其準確度更高，屬于Braun的可接受范圍，故試驗冷鮮雞貨架期模型可靠。

圖1 冷鮮雞中微生物的一級模型

2.2.4 微生物參數與貨架期準確度之間的相關性 由表5 可知，腸桿菌、熱死環絲菌和菌落總數的預測值與貨架期的相關系數分別為0.992 3(P<0.01)，0.992 7(P<0.01)，0.995 1(P<0.01)，即腸桿菌、熱死環絲菌和菌落總數均與冷鮮雞腐敗相關，均可用于冷鮮雞貨架期的預測。

表2 冷鮮雞中微生物一級模型生長參數及模型驗證

表3 平方根二級模型的評價

表4 冷鮮雞貨架期公式及其評價

其中，菌落總數的相關性最高，熱死環絲菌、腸桿菌的次之，說明如果要單一地使用某種微生物參數進行貨架期的預測，選用菌落總數會使計算結果更準確。

2.3 冷鮮雞貨架期微生物預測系統的建立及驗證

選用 Visual Basic 作為冷鮮雞貨架期微生物預測系統的編寫語言，設定軟件基本界面(圖2)和算法后，使用者在無需了解預測微生物模型的情況下，輸入相應的微生物參數便可獲得冷鮮雞貨架期，該軟件程序已獲得計算機軟件著作權，登記號為2020SR0107443。

在奉賢區隨機采取8份市售冷鮮雞，2 h內帶回實驗室無菌操作下將冷鮮雞分成兩份，一份用于初始菌落計數，另一份冷鮮雞放入4 ℃冰箱冷藏，用于感官評定，若冷鮮雞市售時未包裝，則不測定熱死環絲菌的初始菌落數(該狀態下引起冷鮮雞腐敗的主要因素為好氧腐敗菌)。由表6可知，預測系統的相對誤差在9%以內，低于現有文獻[3,12]的最大相對誤差(10%～21%)，其結果更準確可靠。

表5 微生物參數與貨架期的皮爾森相關分析?

3 結論

試驗測定了冷鮮雞貯藏過程中腸桿菌、熱死環絲菌和細菌總數的變化，利用修正的Gompertz模型進行擬合獲得了冷鮮雞的貨架期計算公式，采用皮爾森相關分析比較了微生物參數與貨架期準確度的關系，并通過Visual Basic編寫冷鮮雞貨架期微生物預測系統。結果表明，貨架期計算公式準確度≥0.94；如果以某一種微生物參數進行貨架期的預測，可選用菌落總數,其計算誤差最??；使用者在輸入相應微生物參數的初始菌落數及貯運溫度后即可獲得冷鮮雞貨架期值，且最大相對誤差<9%。后續可開展不同貯藏溫度下冷鮮雞微生物指標與理化指標相關性的研究。

圖2 冷鮮雞貨架期微生物預測系統

表6 冷鮮雞貨架期微生物預測系統的驗證