超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中恩諾沙星、環(huán)丙沙星殘留量的不確定度評(píng)定

施元旭 張水鋒 潘項(xiàng)捷 馮婷婷 王璐璐

(浙江方圓檢測(cè)集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310018)

豆芽品種豐富，營(yíng)養(yǎng)全面，深受百姓喜愛。但豆芽需要在濕度較高的環(huán)境中才能發(fā)芽[1]，而高濕度的環(huán)境又容易造成豆芽的根部潰爛腐敗。同時(shí)，不良商家為了追求豆芽的生產(chǎn)速率和豆芽的外表品質(zhì)，會(huì)在豆芽的生長(zhǎng)過(guò)程中非法添加抗生素類藥物[2-3]、殺菌劑[4-5]等對(duì)人體有害的物質(zhì)，使得“毒豆芽”的問(wèn)題層出不窮。如噴灑恩諾沙星和環(huán)丙沙星藥劑，其主要目的是為了防止根部腐爛。從食品安全角度來(lái)看，豆芽中殘留的恩諾沙星和環(huán)丙沙星會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害，長(zhǎng)期使用將對(duì)人體造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[6-8]。

恩諾沙星和環(huán)丙沙星屬于化學(xué)合成的喹諾酮類抗菌藥物，具有光譜抗菌活性，對(duì)革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的殺滅作用[9-11]。但長(zhǎng)期食用有恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留的豆芽，會(huì)導(dǎo)致人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)嚴(yán)重的功能性疾病。嚴(yán)重時(shí)，可使人出現(xiàn)肌無(wú)力或呼吸肌無(wú)力進(jìn)而危害生命，且還具有一定的遺傳性和致癌性[12]。

評(píng)定測(cè)量結(jié)果的不確定度可以保證檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，同時(shí)，通過(guò)不確定度的評(píng)價(jià)也可以判定試驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的高低。因此，不確定度的評(píng)價(jià)是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系的重要組成部分[13-15]。目前，較多文獻(xiàn)[16-18]報(bào)道研究豆芽中有恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢出，但中國(guó)還未制定豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)擬采用酸化乙腈提取，過(guò)prime HLB柱凈化，氮吹濃縮前處理方法，應(yīng)用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留量進(jìn)行測(cè)定。依據(jù)JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和JJF 1135—2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》評(píng)定豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量檢測(cè)的不確定度，有助于為豆芽品質(zhì)評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆芽：市售；

恩諾沙星、環(huán)丙沙星：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；

恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8：北京Bepure公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)Meker公司；

甲酸：色譜純，美國(guó)ROE Scientific公司；

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 1290-AB Sciex 5500型，美國(guó)AB Sciex公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 稱取5.0 g豆芽于50 mL高速離心管中，準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混合均勻。加入10 g氯化鈉，渦旋混勻，再加入8 mL乙腈，20 μL甲酸，渦旋混合1 min，振蕩提取10 min。高速冷凍離心后，取上清液過(guò)prime HLB小柱，并直接接取流出液。樣品過(guò)柱后，用2 mL 乙腈淋洗小柱。接取流出液在40 ℃條件下N2吹干，1.0 mL初始流動(dòng)相定容，過(guò)膜上機(jī)測(cè)試。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：Aglient RRHD SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫35 ℃；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.1%甲酸水；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；液相色譜梯度洗脫程序：0～1 min，90% B；1.0～3.0 min，90%～10% B；3.0～3.5 min，10% B；3.5～5.0 min，10%～90% B；5.0～6.0 min，90% B。

1.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧(ESI)離子源：正離子模式；掃描模式：多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)；噴霧電壓5.0 kV；脫溶劑氣溫度550 ℃；氣簾氣壓力241 kPa；霧化氣壓力345 kPa。其他參數(shù)見表1。

表1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的主要質(zhì)譜參數(shù)?

1.2.4 數(shù)學(xué)模型

(1)

式中：

X——樣品中恩諾沙星或環(huán)丙沙星的含量，μg/kg；

C——樣品中恩諾沙星或環(huán)丙沙星測(cè)定濃度，μg/L；

V——提取液的定容體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

fr——待測(cè)物質(zhì)的回收率，%；

fQ——液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜校正影響因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的不確定度來(lái)源

根據(jù)試驗(yàn)檢測(cè)步驟和建立的數(shù)學(xué)模型，超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量的不確定度主要有以下幾個(gè)方面：① 測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度urel(X)；② 稱樣量引入的不確定度urel(m)；③ 樣品定容引入的不確定度urel(V)；④ 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度urel(curve)；⑤ 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的不確定度urel(c)；⑥ 回收率測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)的不確定度urel(fr)；⑦ 儀器分析的不確定度urel(fQ)。

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度urel(X) 包括樣品制備過(guò)程的均勻性、樣品提取液和定溶液的濃度和純度、電子天平的穩(wěn)定性、移液器和容量瓶定容等因素引入的不確定度。

平行測(cè)定6份樣品(n=6)，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，結(jié)果見表2。用貝塞爾公式[式(2)～(4)]計(jì)算，單個(gè)測(cè)得值的標(biāo)準(zhǔn)偏差、標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(2)

(3)

(4)

表2 測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度urel(X)計(jì)算結(jié)果

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(curve) 配制5個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別重復(fù)測(cè)定3次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Xi(μg/L)為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)峰面積值(A外標(biāo))與內(nèi)標(biāo)峰面積值(A內(nèi)標(biāo))的比值為縱坐標(biāo)，用最小二乘法擬合，線性回歸方程以及線性相關(guān)系數(shù)R2見表3。

分別重復(fù)測(cè)定樣品溶液6次(p=6)，計(jì)算線性回歸方程導(dǎo)致x0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(5)

urel(curve)=u(curve)/x0，

(6)

式中：

S——標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

x0——樣品溶液平均濃度，μg/L；

b——斜率；

a——截距；

n——測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)溶液的試驗(yàn)總次數(shù)(每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)測(cè)試3次×5個(gè)不同質(zhì)量濃度的點(diǎn))，n=15。

計(jì)算結(jié)果見表4。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度urel(c) 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度主要包括恩諾沙星、環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品的純度、標(biāo)準(zhǔn)品稱量和定容，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋定容、標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度。

(1) 原始標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度：恩諾沙星的純度為99.9%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.25%，取包含因子k=2，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P1)=1.25%/2=0.006 25，urel(P1)=0.006 25/0.999=0.006 256。環(huán)丙沙星的純度為92.31%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.66%，取包含因子k=2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P2)=0.66%/2=0.003 3，urel(P2)=0.003 3/0.923 1=0.003 575。

恩諾沙星內(nèi)標(biāo)的純度為95.3%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1%，取包含因子k=2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P3)=1%/2=0.005，urel(P3)=0.005/0.953=0.005 247。環(huán)丙沙星內(nèi)標(biāo)的純度為(94.8±1.0)%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1%，取包含因子k=2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P4)=1%/2=0.005，urel(P4)=0.005/0.948=0.005 274。

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)純度合成相對(duì)不確定度為：

環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)純度合成相對(duì)不確定度為：

表3 恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

表4 urel(curve)計(jì)算結(jié)果

內(nèi)標(biāo)物質(zhì)均為10 mg，一次性溶解，不存在由于稱量而產(chǎn)生的不確定度。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容引入的不確定度：標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容引入的不確定度來(lái)源分別為定容液的體積膨脹引入的不確定度和10 mL容量瓶引入的不確定。

恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的合成相對(duì)不確定度為：

同理，環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的合成相對(duì)不確定度為：urel(c環(huán)3)=0.012 01。

恩諾沙星內(nèi)標(biāo)溶液稀釋引入的合成相對(duì)不確定度為：

同理，環(huán)丙沙星內(nèi)標(biāo)溶液稀釋引入的合成相對(duì)不確定度為：urel(c環(huán)4)=0.011 99。

10 mL容量瓶定容引入的不確定度，可根據(jù)2.2.5(3)的計(jì)算方法，得到的相對(duì)不確定度urel(c10 mL)=0.003 283。

配制恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的合成相對(duì)不確定度：

樣品中添加恩諾沙星內(nèi)標(biāo)引入的合成相對(duì)不確定度：

因此，配制環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)不確定度urel(c環(huán)5)=0.056 31；樣品中添加環(huán)丙沙星內(nèi)標(biāo)引入的相對(duì)不確定度urel(c環(huán)6)=0.012 01。

標(biāo)準(zhǔn)曲線稀配制過(guò)程和樣品中添加內(nèi)標(biāo)引入的合成相對(duì)不確定度為：

urel(c環(huán))=0.060 67。

2.2.6 回收率測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度urel(fr) 由于目標(biāo)化合物從樣品基質(zhì)中不能完全提取出來(lái)，加上提取、氮吹過(guò)程的損失導(dǎo)致了較大的不確定度，對(duì)樣品前處理產(chǎn)生的不確定度用回收率方法來(lái)計(jì)算。

按照方法的要求對(duì)同一個(gè)樣品重復(fù)加標(biāo)6次(n=6)，上機(jī)測(cè)定恩諾沙星和環(huán)丙沙星的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表5。根據(jù)式(7)計(jì)算得到6次試驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(X)，式(8)計(jì)算得到回收率測(cè)試過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度。

(7)

(8)

表5 urel(fr)計(jì)算結(jié)果

2.2.7 檢測(cè)儀器引入的不確定度urel(fQ) 由《超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜 儀器校準(zhǔn)證書》知，urel(fQ)=2%。

2.3 合成不確定度

恩諾沙星和環(huán)丙沙星的相對(duì)不確定度分量表見表6，若不考慮各不確定度的相關(guān)性，則其合成不確定度按式(9) 計(jì)算。

(9)

通過(guò)式(9)求得：urel(W恩)=0.087 08；urel(W環(huán))=0.104 2。

2.4 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

根據(jù)CNAS-GL006:2018《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》，取包含因子k=2(95%置信度)時(shí)，擴(kuò)展不確定度U=urel(W)×2×X，由此得到豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的測(cè)量結(jié)果，見表7。

表6 恩諾沙星和環(huán)丙沙星相對(duì)不確定度分量

表7 豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星不確定度評(píng)定結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)以豆芽為研究對(duì)象，采用0.1%酸化乙腈提取，prime HLB固相萃取小柱凈化，應(yīng)用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留量進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)數(shù)學(xué)模型，對(duì)豆芽中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量的不確定度各分量進(jìn)行評(píng)定，評(píng)定結(jié)果表明，測(cè)定結(jié)果的不確定度最主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置過(guò)程，其次是儀器的影響和回收率，其他因素的影響較小。因此，試驗(yàn)過(guò)程中，需要操作人員增加試驗(yàn)的平行次數(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)，維護(hù)好檢測(cè)儀器的性能，使其有足夠的靈敏度和精密度，定期做好儀器期間核查和校準(zhǔn)檢定，減少因儀器引入的不確定度。定期對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標(biāo)準(zhǔn)溶液期間核查，保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的可靠性，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。同樣，稱量樣品時(shí)，可考慮選取精度更高的電子天平，或增加稱樣量，來(lái)減少稱樣過(guò)程引入的不確定度，從而提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。