超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定食品中4種減肥類非法添加藥物

朱 呂 陸春燕 厲晨皓 賀慧琳 劉 俊

(平湖市食品藥品檢測中心， 平湖 314200)

雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脫乙酰比沙可啶均為臨床上經常使用的緩瀉劑。雙醋酚汀在腸道內遇堿性腸液，被分解為酚汀及醋酸，酚汀能腸壁引起蛹動，而發揮導瀉作用。比沙可啶是一種于1952年就在國外上市的緩瀉劑，2010年比沙可啶及其片劑已被《中國藥典》收載[1]，它主要通過直接接觸腸黏膜并刺激其感覺神經末梢而增強腸反射性蠕動，促進排便。近年來部分臨床醫生發現長期大量口服比沙可啶副作用較大，尤其是對結腸的刺激或損傷作用，在人結腸測壓中發現比沙可啶可引發高振幅推進性收縮，導致部分臨床工作者對比沙可啶的臨床應用存在一定的質疑[2，3]。酚酞也是一種致瀉藥，能直接刺激腸黏膜或活化腸內平滑肌的神經末梢而增加腸的推進力，因產生過度緩瀉而導致體液與電解質障礙，使血糖升高，血鉀降低，造成電解質紊亂，誘發心律失常、神志不清、肌痙攣以及倦怠無力等癥狀，另外，長期使用可損害腸神經系統，且很可能是不可逆的[4，5]。雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脫乙酰比沙可啶4種化學藥物的結構式如圖1～4。

圖1 雙醋酚汀結構式

圖2 比沙可啶結構式

圖3 酚酞結構式

圖4 脫乙酰比沙可啶結構式

近年來，一些所謂的健康無添加的減肥產品以日常食品為載體，大肆宣稱具有較好的減肥功效，受到愛美人士的追捧。然而，這其實是一些不良商家在食品中非法添加了致瀉類化學藥物，通過致瀉達到減肥目的。有文獻報道，有成千上萬的人是輕瀉劑成癮者。用藥者往往頻繁和持續使用，一旦停用，便秘便會變本加厲嚴重者甚至造成人體器官衰竭[6，7]。不良商家為了逃避打擊，已很少在食品中添加國家明令禁用的化學藥物(如西布曲明、芬氟拉明等)，轉而在食品中非法添加雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脫乙酰比沙可啶等緩瀉劑。除酚酞在食品中的檢測有相關國家標準外[8]，其他3種緩瀉劑均無相應的食品檢測方法和檢測標準，相關的文獻報道主要是藥物片劑分析、人體藥物代謝、藥物動力學性質等[ 9-11]。

目前用于減肥類食品中非法添加藥物的檢測方法主要有液相色譜法[12，13]、液相色譜-串聯質譜法[14-16]、拉曼光譜法[17]等。 其中，液相色譜-串聯質譜法因具有高選擇性、高靈敏度的優點在食品中非法添加藥物的定性及定量分析中獲得了廣泛的運用。本實驗通過優化提取過程、凈化過程和檢測參數建立了一種簡便可靠、可操作性強、準確度高的檢測方法，可用于同時測定食品中雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶的非法添加。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶標準品(純度≥98.0 %)：德國Dr.Ehrenstorfer；甲醇、乙腈(色譜純)：美國Thermo Fisher公司；氯化鈉(分析純)：國藥集團；HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg)、PSA固相萃取柱(3 mL/60 mg)：美國Waters公司；C18固相萃取柱(3 mL/60 mg)：深圳逗點生物技術有限公司；Alumina-N固相萃取柱(3 mL/200 mg)：上海安譜科學儀器有限公司；有機微孔濾膜(0.22 μm)：天津Agela Technologies公司；超純水：實驗室自制。

Waters Xevo TQ-S高效液相色譜串聯質譜儀：美國，Waters公司；T25高速均質機：德國，IKA公司；MS204S、PL602-L 電子天平：瑞士，梅特勒-托利多公司；H2050R-1高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Milli-Q Advatantage A10超純水機：法國，Merck Millipore公司；KQ3200超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；K600多功能食品粉碎機：德國， BRAUN公司。

1.2 標準溶液配制

準確稱取雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶4種化學藥物標準物質各5.0 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成濃度為500 μg/mL的標準溶液儲備液，4 ℃避光儲存。分別吸取0.5 mL雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶標準儲備液至50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成5.0 μg/mL的混合標準中間液。臨用時用流動相逐級稀釋至1.0、5.0、20.0、50.0、200.0、350.0、500.0 ng/mL的混合標準物質工作液。

1.3色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)，流動相A：乙腈；流動相B：20mmol/L甲酸銨溶液；流速：0.5mL/min；進樣量：1 μL；柱溫：40℃。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.4 質譜條件

電噴霧離子源，正離子掃描(ESI+)；多反應監測(multiple reaction monitoring , MRM)；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：450 ℃；脫溶劑氮氣流速：950 L/h；毛細管電壓：3 kV。在電噴霧正離子模式下分別對500 ng/mL的單個標準溶液進行全掃描，通過優化離子源、離子管溫度和輔助氣流量等參數是母離子響應達到最優值，并優化得到每個化學藥物的母離子和子離子所需的最佳去簇電壓和碰撞能量，最后以多反應監測模式進行掃描，選擇離子信號前兩強分別作為定性和定量離子。具體質譜參數見表2。

表2 4種化學藥物的質譜檢測參數

1.5 樣品前處理

稱取粉碎均勻的固體樣品0.5 g(液體樣品1.0 g)于15 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻樣品，超聲提取10 min。加入1.5 g干燥后的氯化鈉，渦旋2 min，8000 r/min離心5 min。準確移取乙腈層5 mL，氮氣吹至約0.5 mL后加入5 mL水渦旋混勻，待固相萃取凈化。

將C18固相萃取小柱安裝至固相萃取裝置上，依次用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱，將待凈化的樣品回溶液加入小柱，流盡后用5 %甲醇水溶液淋洗小柱，吹干，最后用5 mL 80%甲醇水洗脫，收集全部洗脫液于5 mL容量瓶中，甲醇水定容至刻度線，定溶液用0.22 μm有機微孔濾膜后上質譜測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

本研究分別采用了甲醇水溶液、乙腈水溶液、0.1%甲酸水-甲醇溶液、0.1%甲酸水-乙腈溶液和20 mmol/L甲酸銨水-乙腈溶液5種流動相體系進行色譜分析。通過對分離效果的綜合評價，采用20 mmol/L甲酸銨水-乙腈作為流動相時，各組分化學藥物的離子化效率高，分離度、峰型好，響應值高，各組分化學藥物標準溶液(50 ng/mL)的多反應監測色譜圖見圖5。

圖5 雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶質譜圖

2.2 提取方法的優化

本研究對比分別使用甲醇、乙腈作為提取溶劑時的提取效率。結果發現，兩種溶劑對目標化學藥物的提取效率無明顯差異，但是在處理液體樣品時加入鹽離心后，乙腈能夠有效的分離水相和有機相，故最終選擇乙腈作為提取溶劑。

本研究考察了氮吹回溶待凈化液中不同乙腈濃度對4種目標化學藥物回收率的影響。結果如圖6所示，待凈化液中乙腈含量在不超過10 %時，對待測各組分回收率無明顯影響，故樣品前處理時采取移取乙腈層5 mL，氮吹至約0.5 mL后加入5 mL水渦旋混勻成待凈化液。

2.3 凈化方法的優化

本實驗研究了Alumina-N固相萃取柱、PSA固相萃取柱、HLB固相萃取柱和C18固相萃取柱對雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞、脫乙酰比沙可啶回收率的影響。如表3所示， 采用Alumina-N和PSA固相萃取柱時，雙醋酚汀和比沙可啶回收率大于60 %，酚酞、脫乙酰比沙可啶均小于40 %；采用C18和HLB固相萃取柱時，4種化學藥物的均回收率大于70%，相比較C18固相萃取柱穩定性和精密度比HLB固相萃取柱好，故選擇C18固相萃取柱作為本實驗的凈化柱。

圖6 凈化液中乙腈濃度對4種化學藥物(50 ng/mL)回收率的影響

表3 4種固相萃取柱的凈化回收率(n=3)

本實驗考察了以C18固相萃取柱作為凈化小柱時不同濃度甲醇水溶液作為洗脫液時的洗脫效果。將4種目標化學藥物的水溶液上樣，然后分別用濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 的甲醇水溶液洗脫，洗脫液質譜測定，分析不同濃度甲醇水溶液條件下各目標化學藥物的洗脫效果(見圖7)。結果表明，當以80%甲醇水溶液為洗脫溶劑時，目標化學藥物均能夠完全被洗脫。因此選擇80%甲醇水溶液作為固相萃取時的洗脫溶液。

2.4 標準曲線與檢出限

在1.3和1.4中確定的色譜條件和質譜條件下，取混合標準工作液用流動相配制1.0、5.0、20.0、50.0、200.0、350.0、500.0 ng/mL系列濃度的標準溶液進行檢測，以各組分的質量溶度(x)為橫坐標，定量離子的峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，得到各組分的線性回歸方程和相關系數(r2)。如表4所示，4種化學藥物的線性相關系數均大于0.99，表明各組分在1.0 ～ 500.0 ng/mL濃度范圍內均具有良好線性關系。在空白的樣品中添加適量濃度的混合標準溶液，按照1.5方法進行樣品前處理后質譜檢測，以3倍信噪比(S/N)計算方法檢出限(limits of quantification, LOD)，結果見表4。

圖7 洗脫液中甲醇濃度對4種化學藥物(50 ng/mL)回收率的影響

表4 4種化學藥物的曲線方程、相關系數和檢出限

2.5 添加回收率與精密度

稱取空白固體樣品0.5 g(液體樣品1.0 g)若干份，分別添加10.0、100.0、1000.0 μg/kg 3個不同水平的混合標準溶液， 按照1.5的樣品前處理的方法進行前處理，在優化好的色譜、質譜條件下進行測定。每個添加水平平行測定6次，統計數據，計算方法的回收率和精密度。如表5所示，各組分化學藥物的加標回收率在79.2%～111.8%之間，精密度(RSD)為0.21%～13.3%，表明本研究建立的測定方法具有良好的準確度和精密度，可以滿足檢測實驗室日常檢測分析需求。

表5 4種化學藥物的平均回收率和精密度(n=6)

2.6 實際樣品檢測

采用本實驗建立的方法對市售宣稱具有減肥功效的食品及保健食品進行檢測，其中包括固體飲料、酵素類飲料、代餐粉、果脯類、蜜餞類等共計25批次。結果顯示，在25批次樣品中1批次檢出酚酞成分，2批次檢出雙醋酚汀和脫乙酰比沙可啶。

3 結論

建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定食品中雙醋酚汀、比沙可啶、酚酞和脫乙酰比沙可啶4種非法添加化學藥物的分析檢測方法。該方法前處理操作簡便，對不同食品基質凈化效果好，靈敏度、準確度和精密度高，回收率穩定，可用于食品中非法添加化學藥物的檢測工作提供有力技術支持，為打擊食品中非法添加減肥類化學藥物行為提供有力依據，保證消費者的合法利益。