高溫脅迫對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)和云南省致病疫霉生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

王 冰，常婧一，白家琪，晉伊美，楊志輝，趙冬梅

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001）

馬鈴薯是世界上繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物。2015年，中國(guó)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略啟動(dòng)，預(yù)計(jì)在2020年50%以上的馬鈴薯將作為主糧消費(fèi)。同時(shí)，中國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)與中國(guó)貧困區(qū)分布高度重合，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)在當(dāng)前中國(guó)產(chǎn)業(yè)扶貧中發(fā)揮著重要作用。由致病疫霉[Phytophthora infestans（Mont.）de Bary]引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中最具毀滅性的病害之一[1]，一般年份減產(chǎn)20%左右，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%以上，甚至絕收[2]。

病原菌、寄主以及環(huán)境三個(gè)因素構(gòu)成了病害發(fā)生和流行的必要條件，其中溫度是環(huán)境因素中的主要因素。溫度對(duì)病原菌的生長(zhǎng)和繁殖有一定的影響。不同的病原菌對(duì)溫度的適應(yīng)性不同，同一種病原菌不同個(gè)體對(duì)溫度的反應(yīng)也不相同。Peduto等[3]指出白粉病在21～30℃時(shí)流行，高溫可以阻礙白粉病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，36～38℃開始致死，致死時(shí)間隨著溫度的升高而減小。周曉榕等[4]研究了溫度對(duì)蠟蚧輪枝菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響，發(fā)現(xiàn)該菌的生長(zhǎng)范圍為10～33℃，適宜菌絲生長(zhǎng)的溫度為15～28℃，最適溫度為18～25℃；10～30℃均可產(chǎn)生分生孢子，產(chǎn)孢適宜溫度為15～30℃，25℃下產(chǎn)孢量最高，12 和15℃時(shí)產(chǎn)孢量較低。董賢慧等[5]研究了溫度對(duì)茄病鐮刀菌生長(zhǎng)情況及產(chǎn)孢量的影響，表明茄病鐮刀菌的生長(zhǎng)范圍為20～37℃，30℃最適合茄病鐮菌菌落生長(zhǎng)，隨著溫度的升高或降低，菌落生長(zhǎng)速度逐漸減慢。Tooley 和Browning[6]研究了溫度對(duì)橡樹疫霉產(chǎn)孢的影響，發(fā)現(xiàn)橡樹疫霉在20℃產(chǎn)孢量最大，在15℃時(shí)，24 h 即可產(chǎn)生孢子囊，在10 和20℃需要48 h產(chǎn)生孢子囊，然而在4，25 和30℃時(shí)，3 d 后才能產(chǎn)生孢子囊。

馬鈴薯晚疫病是典型的氣傳病害，其流行與溫濕度等環(huán)境條件密切相關(guān)[7]，且其生活史中的重要階段都會(huì)受到溫濕度的影響[8]。溫度能夠顯著地影響菌絲生長(zhǎng)、孢子形成和菌株的存活[9]。在致病疫霉最適生長(zhǎng)溫度的研究中發(fā)現(xiàn)，13～25℃內(nèi)，19℃時(shí)病原菌的生長(zhǎng)率最高，隨著溫度的升高或降低，生長(zhǎng)率逐漸減小，不同地區(qū)的致病疫霉溫度適應(yīng)性不同[10]。Crosier[11]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生孢子囊的適宜溫度是21℃，但是在3～26℃也均能觀察到孢子囊形成。Harrison[12]指出，孢子囊產(chǎn)生的適宜溫度是19～22℃，當(dāng)溫度高于26℃或低于8.5℃時(shí)便不再產(chǎn)生孢子囊。當(dāng)溫度高于12℃時(shí)，孢子囊直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管，溫度低于12℃時(shí)形成游動(dòng)孢子侵染寄主[13]。賈京珠[14]發(fā)現(xiàn)，在15～27℃，18和22℃為致病疫霉的最適生長(zhǎng)溫度，生長(zhǎng)率間無顯著差異，與最適生長(zhǎng)溫度18℃相比，致病疫霉生長(zhǎng)率在15和25℃表現(xiàn)出顯著差異，27℃時(shí)生長(zhǎng)率有極顯著差異，致病疫霉在18℃時(shí)產(chǎn)孢量最大。

本研究通過明確不同時(shí)間高溫脅迫對(duì)致病疫霉生長(zhǎng)及產(chǎn)孢能力的影響，以期為晚疫病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型的構(gòu)建及完善提供數(shù)據(jù)支撐，為病害防控策略制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

研究選取了本實(shí)驗(yàn)室采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的3株和云南省的1株致病疫霉菌株作為供試菌株。菌株具體信息見表1。

1.2 高溫脅迫下致病疫霉生長(zhǎng)速率的測(cè)定

以18℃恒溫培養(yǎng)為對(duì)照，待菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿三分之一時(shí)，每天對(duì)被測(cè)菌株進(jìn)行30，35和40℃高溫脅迫處理3，6 和9 h，連續(xù)處理4 d，再在恒溫18℃下培養(yǎng)，待對(duì)照菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿近滿皿時(shí)，進(jìn)行菌落直徑測(cè)定，分析不同時(shí)間的高溫脅迫對(duì)致病疫霉生長(zhǎng)的影響。每個(gè)處理重復(fù)3皿，共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 菌株信息Table 1 Information of strain

1.3 高溫脅迫下致病疫霉產(chǎn)孢量的測(cè)定

以18℃恒溫培養(yǎng)為對(duì)照，待菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿三分之一時(shí)，每天對(duì)被測(cè)菌株進(jìn)行30，35和40℃高溫脅迫處理3，6 和9 h，連續(xù)處理4 d，再在恒溫18℃下培養(yǎng)，待對(duì)照菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿近滿皿時(shí)，測(cè)量菌株在不同處理下的產(chǎn)孢量。用移液槍在培養(yǎng)皿中各加5 mL ddH2O，制成孢懸液。每皿觀察3次，統(tǒng)計(jì)1 μL 孢懸液中孢子囊的個(gè)數(shù)。利用單位面積產(chǎn)孢量這一相對(duì)指標(biāo)來測(cè)定溫度對(duì)致病疫霉產(chǎn)孢能力的影響，以排除致病疫霉菌落直徑與產(chǎn)孢量之間的相互影響。每個(gè)處理重復(fù)3皿，共進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

單位面積產(chǎn)孢量（個(gè)/mm2）=每皿的產(chǎn)孢量/菌落面積

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)致病疫霉生長(zhǎng)速率的影響

2.1.1 溫度對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)致病疫霉菌落生長(zhǎng)的影響

采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的3個(gè)菌株在不同溫度及不同時(shí)間處理下菌落直徑的變化趨勢(shì)一致。在同一處理時(shí)間下，隨著溫度的升高，菌落生長(zhǎng)受抑制的程度也隨之增加。在同一溫度下，隨著處理時(shí)間的增加，菌落生長(zhǎng)受抑制的程度也隨之增加，但抑制程度小于溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的抑制。在采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的3個(gè)菌株中，NY13-12在不同溫度及時(shí)間的處理下受到的抑制最為明顯（圖1）。菌株NY13-12每天進(jìn)行3 h脅迫，與對(duì)照相比，隨著處理溫度的升高，菌落直徑減小。對(duì)照菌株生長(zhǎng)直徑為83.5 mm，而30，35 和40℃3 個(gè)不同溫度脅迫處理下，其菌落直徑分別為74.5，71.0和60.5 mm，與對(duì)照相比，菌落直徑減少了10.78%，14.97%，27.54%；而隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，供試菌株的生長(zhǎng)被明顯抑制（圖2），在30，35和40℃高溫處理6 h時(shí)，其菌落直徑分別為63.0，56.5和40.5 mm，與對(duì)照相比，菌落直徑減少了24.55%，32.34%和51.50%；在30，35和40℃高溫處理9 h菌落直徑分別為59.5，52.5 和38.5 mm，與對(duì)照相比，菌落直徑減少了28.74%，37.13%和53.89%。

2.1.2 溫度對(duì)云南省致病疫霉菌落生長(zhǎng)的影響

利用3 個(gè)不同高溫對(duì)菌株每天進(jìn)行3 h 脅迫，與對(duì)照相比，供試菌株菌落生長(zhǎng)并未有大的變化（圖3），對(duì)照菌株生長(zhǎng)直徑為85.0 mm，而30，35和40℃3個(gè)不同溫度脅迫處理下，其菌落直徑分別為77.5，76.0和67.5 mm，與對(duì)照相比，菌落直徑減少了8.82%，10.59%，20.59%；而隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，供試菌株的生長(zhǎng)被顯著抑制（圖3），在30，35和40℃高溫處理6 h 時(shí)，其菌落直徑分別為76.0，69.5 和60.0 mm，與對(duì)照相比，菌落直徑減少了10.59%，18.24%，29.41%；而處理9 h菌落直徑分別為71.3，66.5和54.0 mm，與對(duì)照相比，菌落直徑減少了16.18%，21.76%和36.47%。

2.2 高溫脅迫對(duì)致病疫霉單位面積產(chǎn)孢量的影響

2.2.1 溫度對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)致病疫霉單位面積產(chǎn)孢量的影響

利用30，35和40℃的高溫對(duì)采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的致病疫霉菌株每天進(jìn)行3，6 和9 h 的高溫脅迫，與對(duì)照相比，采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的各菌株在30和35℃的高溫脅迫下，單位面積產(chǎn)孢量有明顯增加（圖4）。其中，NY13-8對(duì)照處理單位面積產(chǎn)孢量為108個(gè)/mm2，在30℃9 h的高溫脅迫下，單位面積產(chǎn)孢量達(dá)到了最大值，為1 280 個(gè)/mm2，是對(duì)照的11.85倍。NY15-4對(duì)照處理的單位面積產(chǎn)孢量為63個(gè)/mm2，在35℃3 h的高溫脅迫下，NY15-4單位面積產(chǎn)孢量達(dá)到了364個(gè)/mm2，是對(duì)照的5.78倍。菌株NY13-12在18℃恒溫培養(yǎng)下，單位面積產(chǎn)孢量為1個(gè)/mm2，在30℃9 h的高溫脅迫下，單位面積產(chǎn)孢達(dá)到了125個(gè)/mm2，是對(duì)照相的125倍。當(dāng)脅迫溫度達(dá)到40℃時(shí)，每個(gè)菌株的產(chǎn)孢均受到了抑制，單位面積產(chǎn)孢量減少（圖4）。菌株NY13-8在40℃3 h的高溫處理下，單位面積產(chǎn)孢量為61個(gè)/mm2，與對(duì)照相比減少了43.52%；菌株NY15-4 在40℃3 h 的單位面積產(chǎn)孢量為69 個(gè)/mm2，與對(duì)照相比減少了1.43%；菌株NY13-12在40℃3 h的單位面積產(chǎn)孢量為0.8個(gè)/mm2，與對(duì)照相比減少了20.00%。均低于18℃恒溫處理下各菌株的單位面積產(chǎn)孢量。

2.2.2 溫度對(duì)云南省致病疫霉單位面積產(chǎn)孢量的影響

利用30，35和40℃高溫對(duì)采集自云南省的致病疫霉菌株每天進(jìn)行3，6和9 h的高溫脅迫。與18℃恒溫處理相比，菌株DX16-64在30和35℃的高溫處理下菌株的產(chǎn)孢量都有一定的升高，而且35℃的高溫處理后對(duì)菌株產(chǎn)孢的刺激作用更大，單位面積的產(chǎn)孢量增加的更多（圖5）。對(duì)照菌株的單位面積產(chǎn)孢量為59個(gè)/mm2，隨著溫度的升高在35℃3 h有明顯的數(shù)值變化為175 個(gè)/mm2，是對(duì)照的2.97 倍。但40℃的高溫脅迫對(duì)菌株的產(chǎn)孢有明顯的抑制作用，單位面積產(chǎn)孢量下降（圖5）。DX16-64菌株在40℃3 h的單位面積產(chǎn)孢量為46個(gè)/mm2，與對(duì)照恒溫處理相比，降低了22.03%。

3 討 論

溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)、繁殖和致病力都有很大的影響。了解致病疫霉的溫度適應(yīng)性的規(guī)律和特點(diǎn)，對(duì)深入認(rèn)識(shí)該菌的溫度適應(yīng)性演化和分子機(jī)理、指導(dǎo)晚疫病的測(cè)報(bào)和病害防控策略的制定具有重大意義。

致病疫霉群體在溫度范圍內(nèi)各指標(biāo)呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)，但其個(gè)體對(duì)溫度的適應(yīng)性卻有很大的差異[15]。致病疫霉是典型的低溫適應(yīng)性病原菌，病菌生長(zhǎng)和繁殖最適合的溫度為15～22℃[10]。Chapman[16]評(píng)估了致病疫霉在5，10，15，20，25和30℃下生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況，發(fā)現(xiàn)20℃致病疫霉生長(zhǎng)最快，5 和25℃時(shí)生長(zhǎng)率低，30℃時(shí)致病疫霉幾乎不生長(zhǎng)。在本研究中發(fā)現(xiàn)30、35以及40℃下進(jìn)行不同時(shí)間的高溫脅迫均會(huì)抑制致病疫霉的生長(zhǎng)，隨著溫度的升高以及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用也會(huì)隨之增強(qiáng)，但并不完全抑制其生長(zhǎng)。這與Chapman[16]發(fā)現(xiàn)30℃時(shí)致病疫霉幾乎不生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，一方面，本研究中的高溫處理屬于短時(shí)間的處理，在階段性的高溫處理后恢復(fù)至適溫培養(yǎng)，這樣更加接近自然界中病原菌所處的環(huán)境；另一方面，推測(cè)可能由于全球的氣溫升高，病原菌對(duì)于高溫也具有了更強(qiáng)的適應(yīng)性。同時(shí)，在本研究中發(fā)現(xiàn)采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)和云南地區(qū)的致病疫霉在不同溫度及時(shí)間的處理下，雖然菌落生長(zhǎng)的變化趨勢(shì)相同，但不同菌株受到的抑制程度不同，表明了不同菌株間對(duì)溫度的適應(yīng)性不同。其中采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的菌株NY13-12在不同溫度及時(shí)間的處理下受到的抑制最為顯著，40℃高溫處理9 h，菌落僅為38.5 mm。而采集自云南省的菌株在40℃高溫處理9 h，菌落直徑仍可達(dá)54.0 mm。說明相對(duì)于采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的菌株而言，采集自云南省的菌株對(duì)溫度有更強(qiáng)的適應(yīng)性。溫度的適應(yīng)典型的表現(xiàn)為在溫度升高時(shí)生長(zhǎng)率增加到一個(gè)峰值后，繼續(xù)增加溫度則生長(zhǎng)率降低，適應(yīng)性下降[17]。

變溫處理不僅對(duì)致病疫霉的生長(zhǎng)具有一定的作用，同時(shí)對(duì)產(chǎn)孢也有一定的影響。Miller和Johnson[18]對(duì)致病疫霉分別在18，23和28℃下進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在18和23℃幾乎無差異，而在28℃時(shí)幾乎不產(chǎn)孢。但在本研究中發(fā)現(xiàn)各供試菌株在30和35℃的變溫處理下對(duì)菌落的產(chǎn)孢量有刺激作用，在40℃的變溫處理下對(duì)菌株的產(chǎn)孢有抑制作用。而且，采集自相同或不同地區(qū)的致病疫霉群體單位面積產(chǎn)孢量趨勢(shì)不同，其中，采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的3個(gè)致病疫霉菌株中，NY13-8 和 NY13-12 在 30℃9 h 的高溫脅迫下，單位面積的產(chǎn)孢量最大，而菌株NY15-4 在35℃3 h的高溫脅迫下產(chǎn)孢量最大，說明同一地區(qū)不同個(gè)體間對(duì)溫度的適應(yīng)性差異很大。同樣，采集自云南省的菌株DX16-64在30和35℃的高溫處理下菌株的產(chǎn)孢量都有一定的升高，而且35℃的高溫處理后對(duì)菌株產(chǎn)孢的刺激作用更大，但是產(chǎn)孢量上升的倍數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)的菌株，云南省的年平均溫度高于內(nèi)蒙古自治區(qū)，因此菌株對(duì)高溫的適應(yīng)性強(qiáng)于內(nèi)蒙古自治區(qū)的菌株。說明物種若想生長(zhǎng)、繁殖及進(jìn)化，必須適應(yīng)環(huán)境，所以物種會(huì)通過遺傳分化而形成不同的溫度適應(yīng)性以保證物種的繁衍[19]。